b第三章 目的基因导入细胞.ppt

制备DNA探针早期用放射性同位素进行标记，如32P标记。这样的探针灵敏度高，但有效期短，并且担心放射性污染。后来发展非放射性标记探针，对生物素标记探针、地高辛（Dig）标记探针、荧光素标记探针以及光化生物素标记探针和光化DNP标记探针等。虽灵敏度略低于放射性同位素标记探针，但安全、有效期长，便于操作和保存。 southern杂交 3.3.3.3 PCR法 根据含目的基因两端或两侧已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因，是真的克隆子。此方法的优点是灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基因。 而采用DNA分子杂交的方法，只要在被杂交的DNA中存在目的基因的一部分DNA序列，就会出现杂交信号。 3.3.3.4 DNA测序法 以上方法可确定克隆子是否含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作过程中是否发生了变化，因此必须对目的基因进行核酸测序。 如果待测序的目的基因比较大，测序有困难，也可用RFLP（限制性片段长度多态性）技术。用限制性内切酶对原目的基因和已克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果不一致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，或克隆目的基因的核酸序列发生了变化。经多种内切酶切割分析，若两者结果一致，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核酸序列没有变化。 3.3.3.5 目的基因转录产物检测 通过克隆子筛选和鉴定，证实含目的基因的DNA片段已随克隆载体进入受体细胞，以不同方式进行复制。但还须进一步检测目的基因能否在受体细胞内进行有效的转录。 为此常用RNA印迹（northern blotting）法检测。根据转录的RNA在一定条件下可以同转录该种RNA的模板DNA链进行杂交的特性，制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总RNA杂交，若出现明显的杂交信号，可以认定进入受体细胞的目的基因转录出相应的mRNA。 3.3.3.6 目的基因翻译产物的检测 基因工程的最终目的是获得目的基因的表达产物。基因的最终表达产物是蛋白质（酶），因此检测蛋白质的一些方法可用于检测目的基因的表达产物。 最常用的是蛋白质印迹（western blotting）法。提取克隆子总蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分离后，转移到杂交用的膜上，随后与放射性同位素或化学发光标记物标记的特异性抗体结合，通过一系列抗原抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存在目的基因表达产物。 蛋白质印迹（western blotting） 3.4 基因工程载体和受体系统研究进展 1973年Jackson等人在一次分子生物学学术会上，首次提出基因可以人工重组，并能在细菌中复制。从此以后，基因工程作为一个新兴的研究领域得到了迅速的发展，无论是基础研究还是应用研究，均取得了喜人的成果。这是生命科学发展的一次飞跃，进入了定向改造生物种性的新时代，受到了国内外广泛的重视。 3.4.1 基因工程克隆载体的研究 基因工程的发展与克隆载体的构建密切相关，至今已构建了大量克隆载体。以构建克隆载体的材料分为：质粒载体系统、病毒（噬菌体）载体系统、质粒同病毒（噬菌体）DNA组成的载体系统、质粒同染色体DNA片段组成的基因整合载体系统、以及绿叶体DNA或线粒体DNA构建的载体系统。 以载体的用途分为：通用克隆载体、大片段DNA克隆载体、cDNA克隆载体和表达克隆载体等等。克隆载体有的用于大肠杆菌、有的用于植物、有的用于动物。目前和今后一段时期人将会重点发展适用于真核生物的强表达载体和基因定位整合的克隆载体。 3.4.2 基因工程受体系统的研究 作为目的基因表达的受体系统，早期应用的主要是大肠杆菌和酵母，已有定型的工业生产工艺，由这些受体系统生产的基因工程产品已投放市场。 近些年来，高等植物细胞和哺乳动物细胞也被用作目的基因表达的受体系统，获得了一系列转基因细胞株和少数转基因动植物个体。此外被用作目的基因表达受体系统的还有伤寒杆菌、巨大芽孢杆菌和蓝藻等。 围绕着外源基因导入受体细胞，在DNA化学转化、农杆菌介导和病毒（噬菌体）转导的基础上，发展了电穿孔转化法和微弹轰击转化法等新技术。 围绕着基因的检测，在利用放射性同位素标记探针的基础上，又发展了系列非放射性标记探针的技术；还发展了PCR和RT-PCR技术，使检测基因的灵敏度大大提高。 随着基因工程研究不断深入的需要，将会不断出现新的技术，进一步推动基因工程研究的发展。 3.4.3 应用研究 基因工程技术已广泛应用于医药和农、牧、渔等产业，甚至与环境保护有密切关系。 这里仅就基因工程药物应用研究进展作简单介绍。 3.4.3.1 基因工程药物研究 自从70年代末开始研究人胰岛素等基因在大肠杆菌中表达以