CCK-8 划痕 transwell侵袭.pptx

EGFR抑制剂细胞周期依赖性激酶抑制剂持续的增殖信号逃避生长抑制抗CTLA-4单克隆抗体有氧糖酵解抑制剂细胞内能量异常逃避免疫摧毁诱导凋亡的BH3类似物端粒酶抑制剂抵抗细胞凋亡无限复制潜能促进肿瘤炎症基因组不稳定和突变选择性抗炎症药物PARP抑制剂诱导血管生成组织浸润转移VEGF信号通路抑制剂HGF/c-Met抑制剂Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 2011. I、肿瘤细胞的增殖实验II、肿瘤细胞的迁移实验 III、肿瘤细胞的侵袭实验肿瘤细胞的增殖实验肿瘤的发生和发展过程细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。肿瘤细胞的增殖实验增殖实验各类方法比较方法DNA合成检测代谢活性检测细胞数量检测细胞增殖相关抗原检测ATP 浓度检测 原理放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。通过分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。直接检测活细胞数量的变化。有些抗原（如Ki-67）只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比。 特点最准确可靠耗时长放射性危险灵敏度高操作简便目前细胞增殖应用最为广泛最直接的增殖指标细胞直接计数法操作繁琐费时所需细胞量较多需要组织切片无法进行高通量分析适用于高通量细胞增殖检测和筛选肿瘤细胞的增殖实验代谢活性检测各类方法比较肿瘤细胞的增殖实验CCK-8：实验原理肿瘤细胞的增殖实验实验举例：细胞活性检测研究某基因对肿瘤细胞增殖的影响以A450平均值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线肿瘤细胞的增殖实验实验举例：细胞增殖-毒性检测研究某药物对肿瘤细胞增殖的影响肿瘤细胞的增殖实验实验举例：细胞杀伤效靶比10:1的实验孔效靶比10:1的效应细胞孔效靶比20:1的实验孔效靶比20:1的效应细胞孔靶细胞孔杀伤率计算公式为：杀伤率(%)=[1-(A实验孔-A效应细胞孔)/A靶细胞孔]×100%肿瘤细胞的增殖实验CCK-8：注意事项1当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增大OD值。在做加药实验时，如果药物具有还原性，应在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果OD值有增大，则证明药物有影响，应在加CCK-8之前更换培养基，排除药物的影响。3CCK-8显色时间：贴壁细胞最易显色，加入CCK-8后30min即可肉眼观察显色程度并上机检测；悬浮细胞稍难显色，加入CCK-8后1-4h肉眼观察，若显色困难，则继续培养直到显色完成；白细胞最难显色，需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量（~105个细胞/孔）；不同的细胞需摸索加入CCK-8后的培养时间，以OD值在1左右为最佳。2接种细胞数：贴壁细胞每孔至少接种1×103个细胞/100ml培养基；白细胞每孔至少接种2.5×103个细胞/100ml培养基；进行预实验，梯度接种细胞，摸索接种细胞的数量。肿瘤细胞的迁移实验肿瘤的转移过程恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道， 血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长，称肿瘤转移。肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移必须具备的能力。肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验原理划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）划痕实验是测定肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验步骤1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。2. 在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验步骤3.用200ml枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS洗涤2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。?4．放入37℃?5%?CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。 划横宽度越小，伤口越小 ，伤口愈合能力越强，细胞迁移能力越强； 划横宽度越大，伤口越大，伤口愈合能力越弱，细胞迁移能力越弱。肿瘤细胞的迁移实验划痕