2.基于抗体的细胞化学显示.doc.docVIP

第一篇　组成人体的细胞 第二章　基于抗体的细胞化学显示 在生命科学研究领域，已被成功地应用于捕获靶分子（抗原）、亲和层析纯化蛋白、组织细胞中靶分子定位研究等方向。这些技术所利用的其实就是抗体与抗原发生特异性结合的特性，所有这些基于抗体的研究技术主要可被分为四种类型：①利用抗体示踪靶分子；②利用抗体去捕获靶分子；③利用抗体进行蛋白功能学研究；④通过和芯片技术的结合用于蛋白表达谱研究。 在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。依据实验目的之不同，所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。 一、抗体的标记的直接法与间接法 （一）直接法 直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子结合，通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子进行定性、定位、定量测量的方法。 （二）间接法 间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分子结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体（二抗）与一抗的结合来间接标记出靶分子的存在情况。 二、标记物的选择 是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。表-1所列出的就是一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。 表2-1 标记物的选择 标记物 检测方法 优点 缺点 应用 生物素 与各种标记物偶联的亲和素与链霉亲和素 保存时间长，灵敏度高，检测手段多样 步骤过多，存在内源性生物素干扰，有些底物对人体有害 免疫组化、免疫印迹 荧光色素 荧光显微镜或荧光计 保存时间长，分辨率高 自发荧光，易淬灭 免疫组化 酶 底物显色 保存时间长，灵敏度高，肉眼直接可见，检测手段多样 步骤过多，存在内源性酶的干扰，分辨率低，有些底物对人体有害 免疫组化、免疫印迹 125I或131I γ计数仪、放射自显影 易于直接标记，灵敏度高 半衰期短，对人体有害 免疫印迹、定性定量免疫分析 生物合成 放射自显影、β计数仪 不损伤抗体、操作简便 半衰期短，敏感性低，需杂交瘤细胞 免疫印迹、定性定量免疫分析 胶体金 显微镜、电镜、肉眼 特异性强、灵敏度高、应用范围广、可用于双重和多重标记 对试剂、玻璃器皿内的要求极高，标记物浓度较高 免疫组化、流式细胞术、定性定量免疫分析 第二节 免疫组织细胞染色技术 一、基本概念 免疫组织化学（immunohistochemistry）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像与放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种细胞组织成分，如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等。免疫组织化学的全过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③抗体；④组织细胞标本的制备；⑤免疫细胞化学反应及呈色反应；⑥结果的观察与分析。 二、组织细胞标本的制备 （一）细胞标本的取材 1．体细胞取材方法 （1）印片法：主要用于从活组织检查标本和手术切除标本中获取细胞。首先将标本剖开，最大程度暴露组织病变区，然后将载玻片轻压于病变组织区，吸附脱落的细胞。 （2）穿刺取样涂片法：用细针穿刺从实质性器官（如肝、肾、脾、淋巴结、软组织、骨髓）的病变区吸取病变区的体液，然后进行涂片。 （3）体液沉淀涂片法：主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较少的标本，先通过离心获取细胞沉淀，经适当稀释后再进行涂片。 2．培养细胞取材方法 （1）细胞爬片法：适合于贴壁生长的培养细胞。将干净的盖玻片放置入培养液中，细胞便会自然贴附在其上。 （2）涂片法：适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或通过离心收集细胞，再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。 3．组织材料的获取 主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分为：冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。 （二）细胞和组织的固定 固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来，让蛋白质变性，使内源性消化酶失活。对免疫组化而言，可用的固定剂种类多样，性能也不尽相同，在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响，防止抗原的弥散以及活性的丢失。 常见的固定剂有醛类（如10％的中性缓冲福尔马林，4％的多聚甲醛等）、非醛类（如碳化二亚胺、对苯醌等）、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸入法和灌注法等。 三、免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，进而再利用这种荧光抗体（或抗原）去检