13第十三讲蛋白质分子设计讲解.ppt

第十三讲 蛋白质分子设计（二） 概述 部分氨基酸突变 天然蛋白质剪裁 蛋白质分子全新设计 第三节 天然蛋白质的剪裁 天然蛋白质的剪裁—“中改”，是指在蛋白质中替换1个肽段或者1个结构域的分子操作技术。 蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的，因此 将不同蛋白质之间结构元件成段地替换 期望能够转移相应的功能。 “中改”操作，在新型抗体的开发中已有广泛应用。 谈2个问题：一是抗体剪裁，二是蛋白质关键残基嫁接 一、抗体剪裁 抗体的基本结构：四链结构 四肽链：由2条重链（H链），2条轻链（L链）组成； 结构域：IgG ——H链4个，L链2个； 抗体识别位点组成：由轻、重二链1个结构域的高可变区共同构成。 抗原决定子互补区：抗体分子可变区的一些环状肽段组成的。 一、抗体剪裁 人—鼠嵌合抗体的制备（思路） 利用分子剪裁技术对抗体分子进行剪裁的成功实例 ——实验英国剑桥大学的Winter等。 将小鼠单抗的V区，换到人抗体分子的相应部位上， 使小鼠单抗所具备的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。 单克隆抗体（单抗，McAb）？ 抗体剪裁的医学价值 1、 抗体的人源化 新的挑战： 改造鼠源McAb基因，综合人—鼠嵌合McAb的优点； 获得特异性高、异源性小的，具有临床应用价值的抗体。 为何要人源化？ 相对于“人”杂交瘤细胞系统，“鼠”杂交瘤细胞生长快，产生抗体量大。 鼠McAb用于人体，免疫原性和相对缺乏恒定区依赖的功能效应，使它的应用受到了一定的限制。 改造的必要性： 对鼠源McAb进行蛋白质工程改造，合成人源化单抗。 （1）鼠单克隆抗体恒定区的人源化 将小鼠McAb恒定区用人抗体恒定区代替而拼接成嵌合抗体，既具有抗原结合特异性，又极大地降低了鼠单克隆抗体的异源性。 改造策略和程序： ① 克隆鼠McAb可变区基因——从鼠杂交瘤 提取mRNA→可变区基因cDNA文库→ 表达载体→抗原特异性筛选→可变区基因； ② 选择合适的人恒定区基因； 恒定区基因比较保守，易于克隆获得 ③ 重组载体的构建与表达 抗体分子的糖基化和可变区的折叠、链内二硫键形成， 以及重链和轻链相互作用形成正确的立体构象。 常用哺乳类细胞表达系统 （2）人改型抗体（互补决定区移植） 问题提出： 人源化嵌合抗体的可变区仍具有抗原性。能诱发人产生抗小鼠抗体，导致过敏反应，需对人源化抗体的可变区再进行改造。 抗体可变区组成： 互补决定区（CDR）和骨架区 组成。 CDR：识别抗原表位的区域，直接决定了抗体的特异性；骨架区 ——维持CDR构象 骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱导人抗小鼠抗体的主要原因； 将鼠McAb CDR移植到人McAb的可变区的骨架上，使人McAb获得鼠McAb结合特异性，进一步减少异源性。 互补决定区移植的设计 简单地将CDR序列移植到人源抗体中，甚至完全丧失亲和力。 必须进行互补决定区序列与框架结构的移植设计。 移植设计的原则 将CDR序列和紧邻两侧的骨架序列一起移植； 对骨架区中影响抗原结合部位的aa残基改为鼠源McAb的残基； 人McAb可变区序列的选择：抗体可变区序列数据库分析，选择与鼠单克隆抗体同源性高的人源序列； 保留可变区N末端aa序列，尤其是轻链可变区N末端序列。 将人改型可变区基因与人lg恒定区基因连接，构成完整的人改型基因进行表达。 2、抗体的小分子化改造 小分子抗体？能与抗原结合的抗体小分子V区片段——称~，具识别活性 主要包括4类 Fab抗体：酶水解法：用木瓜水解酶消化抗体可获得2个Fab片段。2条肽链 基因工程方法：在Fab基因表达Fab片段的功能。H链和L链基因分别构建，在2个载体上，共转染细胞，或者构建在一个载体上转染细胞进行表达。 Fv抗体：Fv是由轻链和重链可变区组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功能片段。 2条肽链 分别构建含H和L可变区基因的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性Fv分子；或在一个载体中H可变区和L可变区基因之间设置终止密码子，分别表达2个小分子片段。 单链抗体（ScFv）：将轻链和重链的可变区连接起来的抗体。1条肽链 单价抗体的特点： 优点：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。 缺点：无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学效应。 双价抗体片段：利用单价抗体片段构建双价单特异性抗体和双价多特异性抗体。 3、双特异性抗体（完整抗体） 双特异性抗体( BsAb)？也称双功能抗体或杂交抗体，为非天然抗体。 2个抗原结合部位，具有不同的特异性 化学结构上是双价的，结合抗原的功能上是单价的； 不同于天然抗体（在化学结构及功能上均是双价的） BsAb具有双特异性，能交联2种抗原，可介导标记物与靶抗原结合（造影）。 双特异性抗体制备方