氨基酸分析（参考）.ppt

* 氨基酸选择性反应的分析方法 1、显色分析法 2、荧光法 3、微生物方法 4、酶分析法 * 显色分析法 ?有几种显色试剂只有当干扰物预先除去后才有定量分析的价值。 ?在有些情况下可以通过改变试剂的组成或反应条件以便进行某一种氨基酸的选择性测定。 * 荧光法 ?色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照射下会产生荧光，其它氨基酸与某些有机试剂反应之后其产物才会产生荧光。 ?相对于显色法，荧光分析法的选择性和灵敏度要好。 * 微生物方法 ?微生物方法用于氨基酸分析的原理是：有些微生物的生长和复制需要特定氨基酸的存在。 ?在有限量的氨基酸存在下微生物的生长将受到限制。利用浊度分析法或测定乳酸生成量的增加可对微生物的生长进行评价。 ?微生物方法适合于各种生物样品，可用于大量样品的批量分析，而且分析耗费低。 * 酶分析法 ?一种酶对氨基酸某一种异构体的特异性可 以用于D或L型氨基酸的测定。在这一应用 中氨基酸氧化酶非常有用。 * 存在的问题及发展趋势 ?氨基酸分析中最主要的问题是来自环境的氨基酸的干扰； ?微量氨基酸的分析仍然是一个富有挑战性的课题； ?氨基酸构型分析及手性拆分也是国内外研究的热点。 * 研究应用-测定血浆中氨基酸 * 研究应用-口服水解蛋白成分分析 * 研究应用-羊肉氨基酸成分分析 * 研究应用-鱼肉中氨基酸含量分析 * 研究应用-慢性肝病研究 思考： 分析多肽的结构特点，思考为什么蛋白质的种类如此丰富？ 练习题： 有2个甘氨酸和2个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？ 思考题： 有3个甘氨酸和3个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？ 本章作业： 茚三酮是鉴定氨基酸的最简便方法，查阅文献，写一篇利用茚三酮鉴定氨基酸在实际应用中的小论文。 * * * ?阳离子交换树脂：强酸型磺酸化的 聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。 ?阴离子交换树脂：只有在特殊情况下 用于强酸性氨基酸的分析。 离子交换色谱法 * 1、直接检测法 离子交换色谱法用于氨基酸分析时，可在200nm处对各种氨基酸进行直接检测，检出限在1～10 pmol之间。 * （1）选择性差：生物样品中多种内源 性成分在200 nm处均有吸收； （2）背景高：HPIC常用的各种溶剂在 200 nm处也有吸收。 直接检测的缺点 * 2、柱后衍生化法 ?衍生化是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。 ?大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。 ?为了提高灵敏度及选择性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或荧光法对产物进行检测。 ?常用衍生化试剂：茚三酮、邻苯二甲醛、荧光胺。 * 柱后衍生化法的优点 1、几乎不需要样品处理步骤，蛋白质水解产物可以直接进样分析； 2、反应产物与副产物的混合物无需分离； 3、离子色谱柱的稳定性高，因而样品间的重现性好； 4、反应无需完成，产物也可以是多种。只要混合时间及反应产物的比例是一定的，则分析的重现性就不会受到影响。 5、对反应产物的稳定性要求低，因为反应及检测几乎是同时进行的。 * 氨基酸分析仪 原理：采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。 两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸。 分析效果：灵敏度（最低检测限）比HPLC柱前衍生方法稍低以外（HPLC：0.5pmol；氨基酸分析仪：10pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。 * 氨基酸分析仪 日立7180全自动生化仪 样品的制备 （一）蛋白质的水解 （二）游离氨基酸样品的制备 （三）生理体液样品的前处理 （一）蛋白质的水解 用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，水解方法有三种： 1、酸水解法：标准水解法，水解彻底，但色氨酸被破坏。 2、碱水解法：用NaOH作为水解剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸等被破坏。 3、酶水解法：水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破环，但水解时间长，而且不易水解完全。 （二）游离氨基酸样品的制备 游离氨基酸的样品在分析前必需进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、脱色等处理。在进行分析前建议使用C18小柱处理一下。 （三）生理体液样品的处理 生理体液的样品首先要除去样品中的蛋白质，获得游离氨基酸。除去蛋白质化学方法为： 1、苦味酸法 2、三氯乙酸法