沉淀反应本科（参考）.ppt

免疫学及免疫学检验 第二节 凝胶内沉淀试验 凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为3类：①双相琼脂扩散试验(double gel diffusion test)，②单相琼脂扩散试验(single gel diffusion test)，③凝胶免疫电泳(gel immuno-electrophoresis)。这是一项凝胶内电泳加扩散技术，专门一章介绍。 免疫学及免疫学检验 一、单相琼脂扩散试验 (一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 免疫学及免疫学检验 (二) 操作步骤 1. 将抗体和0.9%琼脂糖50~56℃混合，即刻倾注成平板。 2. 待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。 3. 置37℃，让其向四周自由扩散，24~48h后可见其孔周围出现沉淀环。 免疫学及免疫学检验 单向免疫扩散试验示意图 免疫学及免疫学检验 免疫学及免疫学检验 沉淀环的直径与待检标本内含量不是直线关系，有两种计算方法： (1) Mancini曲线：适用于大分子抗原，扩散时间48h，使用普通坐标纸作图，扩散环直径平方和浓度呈线性关系。 (2) Fehcy曲线：适用于较小分子抗原，扩散时间较短，使用半对数坐标纸作图，抗原量的对数和扩散圈直径之间呈线性关系。 免疫学及免疫学检验 (三) 方法评价 单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。 免疫学及免疫学检验 (四) 影响因素 1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。 免疫学及免疫学检验 2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。 免疫学及免疫学检验 3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所形成的4条标准曲线。 免疫学及免疫学检验 免疫学及免疫学检验 4. 扩散时间 抗原达到扩散终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长。 免疫学及免疫学检验 5. 扩散温度 在4~37℃范围内，提高温度加快扩散速度，缩短反应时间。但有的沉淀环仅在低温下形成，温度高反而消失。在同一次试验的孵育过程中，要防止温度急剧变化，以免出现双圈。 6. 琼脂板厚度 琼脂板厚度增加，沉淀环面积相应缩小。 免疫学及免疫学检验 二、双相琼脂扩散试验 (一) 原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度