方法学评价试验重复性试验TP（参考）.ppt

电泳法 紫外分光光度法 血清(浆)总蛋白(TP)测定 蛋白质检测方法 此法操作简便、快速（5~10分钟），不消耗样品，测定后仍能回收使用，灵敏高，适用于50~100μg测定。但受蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量的影响，干扰因素也较多（各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸，可校正）。故适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质，不适合血清等组成复杂的蛋白质测定，特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。 主要有醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦电泳、双向电泳等。全自动电泳仪在临床的应用也逐渐增多，条带清晰，分辨效果好，能看到蛋白质全貌，但耗时较长，需要特殊仪器。 常用染料有氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等。 氨基黑、丽春红常作为血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂糖凝胶电泳的染料。 考马斯亮蓝(Bradford)1976年由Bradford建立，该法灵敏度最高（1~5μg），试剂配制简单，检测速度快（5~15分钟）、简便，，干扰因素少(强碱性缓冲液；TritonX100；SDS)，颜色深浅随不同蛋白质变化。适用于要求灵敏度高的微量蛋白质快速定量测定，如尿液、脑脊液等。但有染料粘附比色杯上不易洗脱的缺点。 血清(浆)总蛋白(TP)测定 蛋白质检测方法 邻苯三酚红钼也可用于测定尿液、脑脊液蛋白质含量，既不粘附比色杯 ,又具有高灵敏度，已有用于自动化分析测定尿液蛋白质的试剂盒。 还有测定Alb常用的染料甲基橙、溴甲酚紫(BCP)、溴甲酚绿（BCG）等，目前应用最广的是BCG。此法操作简便，灵敏度高，重复性好，适合自动分析；且球蛋白一般与阴离子染料不结合，无干扰作用。是清蛋白测定的常规方法，应用最广。 血清(浆)总蛋白(TP)测定 蛋白质检测方法 利用抗原抗体特异反应 免疫比浊法、免疫扩散法、免疫沉淀法、免疫化学法等 血清(浆)总蛋白(TP)测定 蛋白质检测方法 蛋白质分子中的肽键在碱性条件下，与Cu2+产生稳定的紫红色络合物。与两分子尿素缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与Cu2+的反应相似，故称为双缩脲反应。络合物颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的浓度成正比（与蛋白质分子量及氨基酸成分无关），与同样处理的蛋白质标准液比较，经计算即可求出血清总蛋白质含量。 方法学评价试验---重复性试验 1.样本：收集无溶血、无脂浊、无传染性疾病、肝肾功能正常的人混合血清。 方法学评价试验---重复性试验 2．双缩脲试剂 3．蛋白标准液 4．自动生化分析仪或722型分光光度计，刻度吸管，试管，试管架，微量加样器，恒温水浴箱等 硫酸铜 2.0mmol/L 酒石酸钾钠 31.9mmol/L 碘化钾 30.1mmol/L 氢氧化钠 600mmol/L 酒石酸钾钠可以与Cu2+形成络合物，并维持Cu2+在碱性溶液中的稳定性，避免形成Cu(OH)2沉淀使试剂失效。 碘化钾是抗氧化剂，防止Cu2+还原，从而延长试剂的使用寿命。 氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。 血清(浆)总蛋白(TP)测定 加入物 空白管（B） 标准管（S） 测定管（U1~20） 蒸馏水（μl） 20 — — 蛋白标准液（μl） — 20 — 待测血清（μl） — — 20 双缩脲试剂(ml) 1.0 1.0 1.0 混匀，置37℃水浴10min，以空白管调零，用540nm波长比色，读取各管吸光度值(A值)并计算。 将以上收集的样本分为20份并进行编号，按下表操作： 方法学评价试验---重复性试验 1.根据以下公式求出各个测定管（U1~20）的血清总蛋白的浓度： 2.根据以下公式求出均值和标准差s： 表示各测定值总和；i=1表示从第1个样本值开始加，加到第n个x值，本实验共20个测定值。 方法学评价试验---重复性试验 3.离群值检验 用求得的均值和标准差对20个测定值进行检验，如果其中有一个数据超过X±3S时，该数据为离群值。剔除该数据后补做一个实验数据后重新计算X和s。有两个以上离群值时，重新进行实验，本次实验作废。 4. 计算CV。 方法学评价试验---重复性试验 5. 如试验求得的血清TP双缩脲试剂法的CV值＜WHO对中等实验室提出的OCV(±3%)标准，即表明实验条件的控制达到最佳条件，试验结果可按OCV%报告。作为方法探讨实验，其变异系数应该＜OCV标准。 方法学评价试验---重复性试验 6.变异指数得分（VIS） 方法学评价试验---重复性试验 VI＝V×100／CCV V为变异百分数，X为各室测定结果，X为各实验室结果均值（剔除X+3S以外的结果）, T为靶值,VI为变异指数，CCV为选定的变异系数。 VIS即变异指数得分。VI＜400时，VIS＝VI；当VI＞40时，VIS＝40