基因工程课件（参考）.ppt

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。 (2)平末端连接(blunt end ligate)：目的基因和载体用同一种能产生平末端的酶切割后连接，重组后保留原来的酶切位点。 如Smal CCC? GGG 所用酶量要大. ? GGG CCC 新型连接酶切试剂盒 仅需 37 ℃30分钟. 连接反应条件 1)连接酶的活性; 2) DNA的纯度; 3)载体与目的基因的比例: 摩尔浓度2-3:1 4) PH值7.2-7.8适宜 5)镁离子、DTT(二硫基苏糖醇);ATP. 6)4-15℃(不高于16℃) 7)时间:1-16小时 （二）基因转移 把重组DNA导入受体细胞进行扩增过程。 受体细胞 原核细胞表达系统- 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞 真核细胞表达系统 大肠杆菌 枯草杆菌 受体细胞的基本条件 (1)易接纳DNA分子；(2)对载体复制扩增无严格限制； (3) 限制酶和修饰酶缺陷 (R-, M-)  1)原核细胞表达系统 以大肠埃希表达系统 最常用 优点： 操作简单、增代时间短、价格低廉。 缺点: (1) 多肽分子常不能适当地折叠，使蛋白质常无生物活性。 (2)在菌体内产生的异体蛋白质常对细菌有毒性作用，细菌生长密度低。 (3)细菌缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如在蛋白质上加上磷酸根(phosphate)和糖基. （4）产生的内毒素会给产品提纯带来困难； （5）难于把产物分泌到细胞外部 常用菌株： E.coli K12 JM109; E.coli RR1; E.coli BMH71-18; E.Coli BL21 (DE3)等 枯草杆菌 不产生内毒素， 蛋白质产物可分泌到细胞外. 1981年用枯草杆菌制取干扰素、乙型肝炎病毒核心抗原和口蹄疫病毒的主要抗原，均获得成功。 2)真核细胞表达系统 常用哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞 优点： ①?能识别和除去外源基因中的内含子。 ②?能进行翻译后的加工，提高产品正确构型的机率，与天然蛋白十分相似，保持蛋白质生物活性。 ? ③? 具有遗传稳定性和可重复性。 ④? 表达产物可分泌性。 （1）酵母细胞 优点： 具有真核细胞特点如表达产物的加工，生物产品的活性和稳定性好，能分泌表达，利于纯化。 （1） 不会产生毒素，安全性可靠 （2）遗传背景清楚，容易进行遗传操作 (3)生长繁殖迅速（啤酒酵母菌）， 缺点： 具有活化的蛋白水解酶类(protease)，可降解异体蛋白 质使产品之产量降低。 目前已有数十种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中表达。 （2)昆虫细胞 可利用昆虫病毒(杆状病毒baculovims)做载体。 用昆虫细胞表达系统表达人组织激肽释放酶原 生物技术 2006年06期 优点：同真核细胞 (1)目的基因插入的容量相对大， 蛋白质表达效率高; (2) 比哺乳动物细胞易培养，价廉。 (5) 易操作、安全。 sf21昆虫细胞 目前在农业基因工程上应用较多。 （3）哺乳动物细胞表达系统： ①?能识别和除去外源基因中的内含子。②?能进行翻译后的加工，提高产品正确构型的机率。 蛋白质免疫原性好．为酵母型的16－20倍。????? ?③? 具有遗传稳定性和可重复性。④? 表达产物的可分泌性。 缺点：不易培养、价格昂贵。 优点： （3）哺乳动物细胞表达系统 常用细胞有： 中国仓鼠卵CHO细胞； 小仓鼠肾BHK细胞 绿猴肾COS细胞 小鼠胸腺瘤NSO细胞 小鼠骨髓瘤SP2/0细胞 犬肾内皮MDCK细胞 单链丝状噬菌体 包括 M13噬菌体、f1噬菌体和fd噬菌体 均为单链闭环DNA分子，基因组6.4kb。彼此有很高的同源性。 M13噬菌体 M13噬菌体（+SSDNA） 在宿主细胞内ds DNA 感染宿主细胞 宿主酶系统 双链DNA 复制型 噬菌体增殖 子代噬菌体 释放到菌体外 生活周期既不溶菌也不溶源。 优点：用 M13噬菌体系载体克隆外源基因，可方便获得大量单链DNA分子。 应用：DNA测序（双脱氧链终止法）；制备DNA探针；寡核苷酸定点诱变。 组装成子代单链噬菌体 3. 柯氏质粒或称粘尾质粒(cosmid) 是由入噬菌体DNA粘性末端（c o s区）与质粒重组