抗体的分离纯化原理和测定（参考）.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 双抗体夹心法测抗原的方法： 捕获抗体包被 封闭（3％BSA） 待测抗原 洗涤（含0.1％Tween的PBS) 酶标单抗或多抗 洗涤 显色 检测 1）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。 方法：抗体包被 封闭 同时加入待测抗原和酶标抗原 洗涤 酶底物 显色 ELISA reader检测 (3)竞争法测抗原 2）抗原固相测抗原 其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。 方法: a: 抗原包被96孔板； b:封闭; c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入96孔板 e: 洗涤 f：加入酶标二抗 g：洗涤 h：显色和检测 如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测 （4）IgM抗体的检测 1）间接法： 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。 因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。 方法 a: 抗原包被96孔酶标板； b:封闭; c: 待测血清与A蛋白反应一定时间后离心 d: 吸取上清液加入96孔酶标板 e: 洗涤 f：加入酶标抗IgM的抗体 g：洗涤 h：显色和检测 （5） ABC-ELISA技术 （Avidin Biotin Complex-ELISA 原理 亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。 操作过程： 抗原包被 封闭 待检标本 生物素化抗体 洗涤 酶标记亲和素 洗涤 加底物显色和检测 E E 生物素 亲和素 底物 酶 图8-11 ELISA (ABC)法 E （二） 免疫荧光技术 利用某些荧光素，如FITC(异硫氰酸酯)、RB-200(罗丹明)等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 　　　 搅拌法　　 抗体溶液 逐滴加入FITC溶液 搅拌4～6h 离心 荧光抗体制备方法 搅拌法： 　　　适于体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液　 优点：标记时间短，荧光素用量少 缺点：影响因素多 易引起较强的非特异性荧光染色 透析法 TITC 抗体溶液 FITC标记 的抗体溶液 反应过夜 PBS 搅拌法： 　　　适于标记抗体量少，蛋白含量低的抗体溶液　 优点：标记比较均匀，非特异性荧光少 缺点：所需荧光素量多，时间较长 荧光抗体的鉴定 FITC F/P= RB200 F/P= 2.87×A495 A280－0.35×A495 A515 A280 固定标本　　F/P =1.5 活细胞染色　F/P =2.4 涂片和印片组织切片 细胞培养标本 活细胞　　 固定 染色 荧光显微镜检查 二、免疫荧光显微技术 标本 1、程序 ２、实验类型及原理： 　　间接法 　　直接法