抗体的选择2（参考）.ppt

搭配荧光素原则 搭配流式荧光素有2个原则： 1、每个通道只能选择1种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配，但需注意1、每个通道只能选择1种荧光素。以Calibur为例说明，Calibur的FL1通道选择了FITC就不能选择AlexaFluro488，或者选择了Alexa Fluro488就不能选FITC Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五个荧光素，但是我们搭配的时候只能选择其中1个。 2、各个通道之间的荧光素可以随意搭配：如果客户的流式细胞仪能做4个通道，在第1个原则之下，那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。以2跟激光的Calibur为例，Calibur各个荧光素之间可以搭配出16种组合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 这个搭配组合可以更改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等。总之，在第1原则之下，我们可以随意搭配和组合各个荧光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的话，上流式以后，容易导致补偿过度。 供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的。我们需要根据同时结合供应商能提供的每种抗体的荧光素进行搭配。原则上同一个标志的不同的克隆号带同1个荧光素在应用上没有区别的，但是有些不同克隆号的抗体之间可能会有一些稍微的差异，需要仔细看说明书。我们可以尽量选择在说明书上有流式图形的抗体，或者选择荧光素种类最多的克隆号的抗体。 为什么某些品牌的流式细胞仪要推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？ 因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对pH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。 如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？ 如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。 1、为什么要用同型对照？ 同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前，染色方式如下： 样本管：一抗＋样本同型 对照管：同型对照＋样本 2、如何选择同型对照？ 一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56 APC标记的抗体，货号是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的Mouse IgG1,κ，货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的。 如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体，货号是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ，货号是555746。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下： 样本管： 纯化的CDw25＋PE标记的抗Mouse IgG1＋样本 同型对照管： 纯化的同型对照＋PE标记的抗Mouse IgG1＋样本 如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同－－相同类别。比如，某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b，那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。 哪些客户需要使用同型对照？ A 对流式不是非常熟悉的客户。 B 做胞内流式客户，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。 C 使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户，因为客户不熟悉不常