酶联免疫吸附试验（参考）.ppt

包 被 液 0.05M PH 9.6 碳酸盐缓冲液 Na2CO3 1.59 g ； NaHCO3 2.93g ； 加蒸馏水至1000ml PBST 洗 液 2000ml PBS + 1ml Tween-20 PBS： NaCl 8g ； KCl 0.2g ； Na2HPO4 1.42g；KH2PO4 0.27g； 加1000ml蒸馏水定容，调PH至7.4 洗 板 机 封 闭 用封闭液封闭，每孔100μ。 室温下，在微量振荡器上，封闭2h。 弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。 用PBST洗液，洗4~5次。（同包被） 用保鲜膜包好，4℃可保存一个月。 封 闭 液 10 % 小牛血清 （1ml小牛血清加到9ml 1×PBS中混匀）。 5%脱脂奶粉（用洗液稀释） 脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。 加标准样及样品 待测样或标准一抗： 用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育2小时。清洗。 二抗： 用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育1小时。清洗。 注 意 抗体抗原反应比较快，一般1~2个小时就达到峰值。延长反应时间容易出现非特异结合，但反应时间不能少于1.5小时。 二抗的使用浓度（一般，1：10000稀释）应当进行预实验确定，二抗的反应时间不能过长，容易出现非特异反应。一般，反应40~60分即可。 OPD 显 色 临用前取A液5.14ml，B液 4.86ml加入OPD (邻苯二胺，在-20℃中保存）0.0040g（约4小片），溶解后加入50μl的30%H2O2，配成显色液。（OPD要充分混匀，否则容易出现个别孔颜色太深） 显色液每孔100μl。避光显色15~20min。 用2mol／L H2SO4终止反应，每孔50μl 显 色 液 A液：0.2mol ／L Na2HPO4 Na2HPO4·12H2O 71.7g加水至1000ml B液：0.1 mol ／L 柠檬酸 柠檬酸 19.2g 柠檬酸，加水至1000ml 结 果 判 定 酶标测定仪检测（429nm）， 测定OD值： 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性 注意：要有阴性，阳性对照。 影 响 因 素 1? 标本的影响 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 可能是溶血血清中含有过氧化酶物质 标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶 标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性 标本凝固不全 血清中仍残留部分纤维蛋白原 2? 试 剂 影 响 ELISA检测试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此，选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 3? 操作技术的影响 吸量的准确性? 吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗，定期校准 温浴影响 抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求 加样次序影响 有时我们在加样过程中，常常会遇到个别标本未离心等情况，为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后等标本分离好后再加标本，这样常常会造成假阴性。 洗涤方法对结果的影响 洗涤是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果 4? 干扰物质的影响 有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果 ； 常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等 CD4+、CD8+检测试剂盒  BA-ELISA 双抗体夹心ABC-ELISA 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体， 往包被抗体的微量孔中依次加入 待测T淋巴细胞、生物素化的抗CD4+抗体、HRP（辣根过氧化物酶）标记的亲和素 经过彻底洗涤后用底物TMB显色。 TMB（四甲基联苯胺是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应）在经过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CD4+呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 C