免疫共沉淀原理及注意事项（参考）.pptVIP

未检测到目得蛋白或蛋白很少 可能原因 处理方法 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位 6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液 目得蛋白高背景： 可能原因 处理方法 非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞； 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗， 免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂） 裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液 实验仪器或液体被污染 使用洁净的仪器或液体 转移膜上的非特异吸附 戴手套， 用镊子夹取， 不要接触膜转移面 试剂 RIPA Buffer 蛋白酶抑制剂（aprotinin、leupeptin、pepstatin）、PMSF。 洗涤缓冲液PBS Protein A agarose琼脂糖 抗体 仪器、耗材 摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗干净风干） 免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation， Co-IP） 单系金 一 实验原理 以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？ Y-X-抗X CO-IP应用与IP区别 测定两种目标蛋白质是否在体内结合 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白） 实验基本原理 1.提取蛋白 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—Protein A或G 3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体） proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合 agarose bead 琼脂糖珠 CO-IP原理图解 proteinA/G-琼脂糖珠复合物 Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。 ProteinA/G的作用及具体原理 “捕获”抗体，形成复合物， 抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合 ProteinA/G-garose beads 共价结合 加样缓冲液-煮沸变性-离心 Protein A/G beads↓ EP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。 二 CO-IP特征 优点 （1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态 （2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响 （3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物 二 CO-IP特征 局限性 （1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用 （2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用； （3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。 三 实验流程 提取细胞总蛋白 ↓ ↓ 离心，上清电泳(抗原抗体) 准备PA珠子，PBS洗3遍 ↓ PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景) ↓ 离心去PA珠子，取上清 ↓ 测蛋白