免疫亲和纯化和免疫沉淀（参考）.ppt

　5、裂解物的预处理：将裂解物通过一系列模拟免疫沉淀的步骤，将不能识别靶抗原的抗体加入裂解物内，如同正常免疫沉淀进行操作，去除所有可能污染免疫沉淀最后步骤的非特异蛋白。优点主要是降低非特异本底，缺点是费时。如最后检测是免疫印迹则无需此步。 6、免疫复合物的纯化： 　影响因素： (1)抗体的用量； (2)免疫沉淀的体积； (3)蛋白A与蛋白G的选择。 蛋白A 蛋白G 母牛 √ 狗 √ 驴 √ 山羊 √ 豚鼠 √ 马 √ 人 √ 小鼠 √ 猪 √ 家兔 √ 大 鼠 √ 种属 同种型 蛋白A 蛋白G 小鼠 IgG1 √ IgG2a √ IgG2b √ IgG3 √ 大鼠 所有 √ 人 所有 √ 多克隆抗体 单克隆抗体 蛋白A与蛋白G的比较 　 谢谢大家！ 　 Thank you very much. * 免疫亲和纯化层析的基本操作步骤：交联→结合→洗脱 1、将抗体与基质（微珠）共价交联并制备抗体亲和层析柱。 2、将抗原结合到抗体-基质微珠上。 3、抗原的洗脱。 亲和层析条件的选择： 　（1）支持物与抗原或抗体结合后，还可能有多余的活性基团， 为了封闭这些残基团，必须用无关蛋白质或三乙醇胺过一次柱，以封闭活性基团。 　（2）去掉未结合及结合不牢固的蛋白质。 先用0.2 mol/L NaHCO2（含0.1 mol/L NaC1，pH 9.0）洗脱2～3个柱体积，再用解脱剂处理一次亲和层析柱。 　（3）解脱剂有多种：常用的有0.2 mol/L pH 2.8 甘氨酸－HC1缓冲液、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液、7 mol/L脲、5 mol/L NaI、3 mol/L硫氰酸钾（或钠）、1 mol/L乙酸、6 mol/L盐酸胍、0.2 mol/L KC1等。作为抗原抗体解脱剂，最多用的是3 mol/L硫氰酸钾（或钠）及0.1 mol/L pH 2.4甘氨酸缓冲液。 抗体亲和层析柱的制备： 　抗体与固相基质的连接： 　1、最常用的基质为蛋白A和蛋白G微珠， 可与抗体的Fc功能区特异结合。 　2、将抗体直接与一种活性微珠（表达活 性的反应基团）连接。 抗体与微珠的结合方法 试剂 优点 缺点 与抗体结合的基团 蛋白A 抗体定向确切， 粒柱还能与其他无关 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易结合 的抗体结合，昂贵 蛋白G 抗体定向确切， 粒柱还能与其他无关 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易结合 的抗体结合，昂贵