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4 固定化酶的性质 2.2辅酶的固定方法 辅酶的固定方法主要有两种：载体结合法和包埋法。载体结合法与捕基固定方法相似，主要用于制备亲和吸附利。包埋法中，由于辅酶相对分子质量小，先将辅酶与水溶性高分子结合，然后再来包埋。这种包埋和酶的包埋法相似。因此，辅酶固定化包括：引入一个功能基团，生成辅酶衍生物，再与水溶性高分子聚合物结合。 2.2.1引入功能基团 对于一些腺苷酸的辅酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反应分别如下： b.纤维素等载体在碱性条件下和均三氯三嗪等反应，引入活泼的卤素基后，能与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶。 与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是3-F-4，6-二硝基苯。控制pH＜7，使它勺酶分子的氨基反应，产生固定化酶。 c.四元缩合反应 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和异氰酸)发生缩合反应，形成N—取代的酰胺。在反应中，羧酸(R1)和胺化合物(R2)形成酰胺键，醛(R3)和异氰酸(R4)结合形成酰胺氮的侧链： 当选择适当条件，适当的载体及控制反应液中的添加物，可以使连接键或通过酶的氨基或通过羧基，将酶固定并免除有害反应。例如：在乙醛和小分子的3—(二甲氨基)—丙基异氰酸存在下，用0.5mol/L HCl维持pH6.5，搅拌反应6h，用带氨基的聚合物，可以与酶分子的羧基偶联。而带—COOH的高聚物在醛和异氰酸存在下，可与酶分子的—NH2偶联。 d.巯基—二硫基交换反应 带有—SH或二硫基的载体，通过巯基—二硫基的交换反应，和酶分子上非必需巯基偶联。若载体的功能基团为—SH时，可先用2，2’—二吡啶 二硫化物处理，生成的二硫基中间产物在酸性条件下能与酶分子的巯基发生交换反应，从而产生固定化酶。 此法通过小分子巯基化合物的运转，使载体可以再生： e.金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体(纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等)浸泡24h，洗除末反应的金属盐后，制得的活化载体放入酶溶液中，即可 将酶固定化。如： f.缩合反应 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚胺活化后，与酶分子的氨基或羧基直接偶联，形成肽键，产生固定化酶。—般在弱酸条件下(pH4.75—5)将酶、羰二亚胺、载体同时混合，羰二亚胺与载体的羧基反应生成活泼的O—乙酰异脲衍生物，与酶分子的氨基缩合成肽键或者重排为酰基脲。 例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物为载体用缩合法制备固定化胰蛋白酶。0.95g丙烯酸用3mol/L NaOH调pH6.5，加入1.95g丙烯酰胺和0.1g N，N’—甲叉双丙烯酰胺，再加入 0.1mol/L pH6.5磷酸缓冲液，使体积为10m1，加入25mg过硫酸铵和22ulN，N，N，N’，N’—四甲基乙二胺，抽真空除气泡，4聚合30min，压挤成粒，搅拌下水洗．丙酮干燥备用。 70g干胶在20m10.5mol/L HCl中搅拌30min，用水和 O.1mol/L pH 6.5磷酸缓冲液洗涤后转至小烧杯，加入3.5ml 0.1mol/L pH6．5磷酸缓冲液的8.75mg胶原蛋白酶后，搅拌5min，接着加1—环己基—3—(2—吗啉乙基)—羰二亚胺甲基—对甲苯磺酸，连续搅拌18h，洗涤后即为固定化酶。 g.叠氮反应 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反应。 此法常用载体有羧甲基纤维素、CM—Sephadex、聚天冬氨酸、BioGel.CM—100、乙烯—顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下： 以CM一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCl气体，使之饱和。室温下过夜，并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤，并空气干燥。将产物悬于甲醇中，加入80％水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，干燥。其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2％HCl在冰浴中混合，搅拌下滴加9ml %3 NaNa2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤．再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH8．7磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5℃搅拌反应2—3h，用HCl凋PH4，冷0.001mol/L HCl洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶。 j.异硫氰酸反应 含有芳香氨基的载体，在碱性PH条件下，与光气或硫芥子气反应．生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生