Lecture4-e花环试验讲解.ppt

E花环试验Erythrocyte Rosette Test 豚鼠T细胞表面有E受体=CD2. 家兔红细胞（RBC）表面有CD2的配体，即CD58. 将淋巴细胞与RBC按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个T细胞结合多个SRBC的玫瑰花一样的花环，即E-花环(erythrocyte rosette)，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率。 实验材料 (一) 1×107/ml豚鼠淋巴细胞 在血球计数板记数淋巴细胞数，并将其配成1×107/ml 浓度的淋巴细胞悬液。 (二) 1×108/ml家兔红细胞 用注射器吸取２ml的阿氏液, 心脏采家兔血2ml 2000r/min离心10分钟 以Hanks洗三次（2000r/min离心10分钟）。 用Hanks液配制成1×108/ml悬液。 取0.1ml 107/ml淋巴细胞悬液置于试管中 ? 加入0.1ml 108/ml RBC ? 加入0.05ml 灭活小牛血清 ? 置于37oC水浴，25min ? 低速离心，500rpm, 5min ? 加1滴0.8%戊二醛固定10min ? 再加入1滴美兰染色1min ? 取1滴高倍镜下计数花环形成率 结果判断 1.SRBC与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，在Et花环试验中，置4℃应至少1h以上或过夜。 2.绵羊红细胞以保存1周内最好，超过2周则与淋巴细胞结合力下降，超过5～6周则不能再用。 3.Et花环试验SRBC与淋巴细胞混合比例以100∶1～200∶1为宜，Ea花环试验中以10∶1～20∶1为宜；淋巴细胞离体后不能超过6h，否则会影响花环形成率。 4.温度对实验结果影响较大，故实验温度条件应保持一致，从4℃取出后应立即计数。 5.计数前将沉淀细胞重悬时，使细胞团块松散均匀即可，不可强力吹打，以免SRBC从淋巴细胞上脱落。 * * E-花环实验原理 CD2 and CD58 smilar structure ? ligand of CD2---CD58 ligand of CD58---CD2 ? CD2 also called SRBC-R(绵羊红细胞受体) 1.密度梯度离心法 粒细胞和红细胞 (1.092g/l) 分离液 (1.077±0.002g/l) 淋巴细胞单核细胞 1.070g/l 血浆层 豚鼠外周血 淋巴细胞分离液 离心 2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺 豚鼠淋巴细胞的分离 操 作 流 程 心脏抽取2ml血至含2ml阿氏液注射器中 ，加入2ml Hank’s液 取3ml稀释血，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中 2000rpm，离心20min 小心吸取淋巴细胞层，加入5倍体积的 Hank’s液 2000rpm，离心10min 弃上清，加入5倍体积的 Hank’s液 2000rpm，离心10min 弃上清，加入1ml Hank’s液 细胞计数 E-花环实验操作骤 高倍镜下计数200个以上的淋巴细胞。 阳性细胞：受检淋巴细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞(TRFC)。 TRFC（%）= TRFC×100％ 未形成花环淋巴细胞数＋TRFC 正常参考值 总E-花环形成率（Et）为60%-80% 活性-E花环形成率(Ea)仅为Et 的1/3-1/2，约20％-40％ 总花环（Et）: 如置4℃至少2h或过夜，所检出的E-花环称为总花环（Et），亦即T细胞的百分率. 活性花环（Ea）: 如减少淋巴细胞与SRBC的比例，经短时间的温育即行取样涂片镜检，仍可见部分E-花环，称为活性花环（Ea）。 * * *