脂肪酶的提取.doc

黑曲霉发酵生产α-淀粉酶前言：α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养 空消 实消接种 发酵 放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。黑曲霉α-淀粉酶发酵pH值酶活残糖量生物量碘液：称取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，于褐色试剂瓶内保存，避免阳光直射。（2）稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。此溶液现配现用（3）0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5克，加5ml缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的缓冲液中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，定容至100mL。此溶液需要当天配制(4) 磷酸缓冲液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)蒽酮试剂。溶解0.2 g蒽酮于浓硫酸（A. R. 95.5 %）100 ml中，当日配制试用。具体实验过程中，应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。发酵罐的几大系统即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。空气系统： 空气除菌设备：空压机 贮气罐 油水分离器 空气流量计 空气过滤器 发酵罐进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口）（3）管道：包括水流通管道和气流通管道水流通：冷却用水：水经过进水管道 发酵罐夹套 出水口 保温用水：关闭进出水管道阀门（水注满后） 加热保温 进入夹套 气流通：蒸汽发生器 蒸汽管道 空气过滤器/发酵罐 进入罐内 空气：空压机 贮气罐 油水分离器 空气流量计 空气过滤器 发酵罐 空消 先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行： 1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。 2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。 3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。 4．罐压升至所需温度（121℃）时开始计时，保温保压30min。 保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。 5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。近罐空气阀的尾阀要一直微开启。 注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。 种子制备：接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。 培养基配制、实消 发酵培养基配方：可溶性淀粉200 g，柠檬酸氢二铵100 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，FeSO4.7H2O 0.05 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH5.0，消泡剂（植物油）5 mL。 关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、保温30分钟→实消结束。 冷却接种与发酵 待培养基冷却至28℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。 将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。参数监测 每隔6 h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。 Ⅰ. pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。 Ⅱ. 生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3-5 min)离心，收集上清液用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2 h左右），然后测其干重，取平均值。 Ⅲ. 酶活： 取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入适当稀释的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4 终止反应。取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色，在620 nm处测光