X-GAL和IPTG的配制.doc

X-Gal X-Gal也称5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside或5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。 　　分子式为C14H15BrClNO6，分子量为408.63，CAS Number 7240-90-6。 　　X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝色。基于这个特点，pUC系列载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。 　　使用方法 ： 　　首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液（-20℃避光保存），然后在100 ml的琼脂培养基中，加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG（24 mg/ml）和100 μl的Amp（100 mg/ml），制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培养基。当DNA片段插入至pUC系列载体（或其他带有lacZ、Amp基因载体），然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的X–Gal、IPTG、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体（白色为具有DNA插入片段的基因重组体）。 　　注意事项 ： 　　◆ 培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：50 μl/3 ml（20mg/ml）。 　　◆ 含有X-Gal的培养基4℃避光保存，须在1~2周内使用。 IPTG 　　中文品名: 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 　　商品名称: Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside 　　英文简称: IPTG 　　产品别名: Isopropyl β-D-Thiogalactoside 　　产品纯度: Sigma ≥99%, Merck ≥98% ，INALCO≥99% 　　产品性状: 白色或白色粉末,溶于水后呈清亮无色液体 　　分 子 式: C9H18O5S 　　分 子 量: 238.30 　　保存温度: 2-8°C冷藏保存 ,配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月 　　主要作用：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用 　　IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。 诱导原理 首先 　　E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I（图15-4）。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节实现基因产物的协调表 达 。 其次 　　在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结 合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷 酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一 种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 使用方法 　　首先把IPTG配制成24 mg/ml（100 mM）的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然 　　后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl的上述溶液、200 μl的X-Gal（20 mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液）和100 μl的Amp（100 mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板