毛细管电泳原理及其应用.docx

毛细管电泳原理及其应用学院：海洋港口学院 班级：14制药工程 学号：1423014113 姓名：蒋佳丽 时间：2015年1月7日前言 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是近十几年来迅速发展起来的一种分离技术，虽说在上世纪六七十年代就有人对毛细管内电渗流形式做了理论探索并也开始尝试毛细管电泳技术，但都因为受到检测器灵敏度限制、电泳过程中产生的焦耳热无法有效散失等因素的制约，影响分离效果。八十年代初，外壁涂有聚二酞亚胺，内径小于100}m的熔融石英毛细管的使用[1]及检测器灵敏度的提高大大推动了毛细管电泳技术的发展，由于CE具有普通电泳和色谱的优点及具有高效、高灵敏度、快速、低运行成本、犬信息量和易于自动化等特点，近年来在生物化学、临床诊断、法医刑侦学等领域应用广泛。一、CE设备及原理 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品各组分之间的淌度及分配上的行为差异而实现分离目的的一类液相分离技术。其仪器装置一般由以下几部分组成(见图一)1.高压电源;2.毛细管;3.在线检测器;4.电极及电极液;5.加样系统。毛细管是由熔融石英加工制成的(内径20一100}m，长度为20一100cm )，外壁涂有一层聚二酞亚胺以增加其柔韧性，内壁通常直接和溶液接触，有时也可根据需要涂上一层高聚物。与平板凝胶电泳类似的，毛细管内也可填充支持介质，如琼脂糖，聚丙烯酞胺及甲基纤维素等。图一毛细管电泳仪装置示意图(Tagliaro, 1998)[1] 在线检测器位于距样品盘约三分之二至五分之四毛细管总长处，对毛细管壁内部进行光学聚焦(在此处的毛细管外壁的保护层是被烧掉或刮去的，以利于光的通透)。在线检测器通常有紫外、荧光和激光等多种检测方式。对DNA的分析通常使用紫外检测，对200bp的DNA片段的最小检测浓度是O.5mg/L。但对于生物样品中在和许多其他成分共存的痕量物质测定时，或对特殊分析(如DNA序列测定)时就要使用激光诱导的荧光检测器(laser induced fluorescence, LIF)，使用LIF在非液相毛细管电泳中的检测灵敏度要比非激光诱导的荧光检测提高6倍[2]，比紫外检测高100倍。另外，加入染料EB还可改善分离度，能将碱基长度相同但序列不同的DNA片段分开[3]。 毛细管中充满具有一定离子强度的缓冲液后，在其两端加上高电压，带电粒子在电场作用下以不同速度向其所带电荷反方向迁移，当pH3时，毛细管内壁的石英分子因玫Siq分子的解离，而在表面形成一层负电荷，吸引缓冲液中的正离子，形成一个双电层。在高电压作用下，双电层水合阳离子层引起整个溶液在毛细管中向负极方向移动，形成电渗流。带电粒子在毛细管内的电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流二者的矢量和，因此阳离子首先从负极流出;中性离子的速度等于电渗流速度，随后流出;而由于电渗流速度大于电泳速度，因此阴离子最后流出。 内壁石英分子除能造成电渗流外，还会吸附溶质中带正电荷的分子，从而影响分离效果。为了避免分析物被管壁吸附，可选用缓冲液的pH大于样品混合物中蛋白质和多肤的等电点，或者选用pH接近pH2.0，此时毛细管内壁无解离的负电荷，但在这种酸性环境下，蛋白质容易失活，一般仅用于多肤分析。有时也可对毛细管内壁进行涂层，如中性共价涂层可以消除电渗，或采用改变内壁电荷的极性的可逆涂层方法，适用于等电点偏高的蛋白质的分离分析。尤其在蛋白质和多肤的分离分析中，毛细管内壁表面与分析物的疏水作用、静电作用、氢键、范德华力作用等都会影响分离效果。对毛细管内壁进行涂层有时是必须的[4]。 与平板凝胶电泳手工进样不同，CE现在多采用两种自动进样方式:流体力进样和电动进样。前者通过压力推动或真空吸人，无选择性;后者施加了电势，具有选择性，会因样品中组分的移动性和离子电荷不同而异。虽然电动进样具有选择性的优势，但进样过程会受到多种因素的影响，实际操作中应注意实验条件以获得更好的重复性。二、CE的分离模式根据分离机理不同，毛细管电泳大致可以分为以下几种模[1,5]:2 .1毛细管区带龟泳(capillary zone electrophoresis, CZE) 毛细管中只有电泳缓冲液，根据待分离物质的荷质比差异进行分离，应用广泛。2.2毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,%〔) 毛细管中填充有呈凝胶状的支持介质，这点与平板凝胶相似;也可以是甲基纤维素溶液，后者便于清洗，毛细管可多次使用。在溶液中，甲基纤维素分子在电镜下呈现缠绕状，其作用机理类似于凝胶的筛网作用。2.3毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing, CIEF) 根据蛋白质和多肤的等