细胞培养技术.doc

一、设施：1实验室房间.　　2.超净工作台.　　3冰箱：4℃冰箱和低温冰箱。 4显微镜（倒置显微镜＋摄像系统）。5二氧化碳孵箱。　　6离心机。　　7恒温水浴箱。　　　8深低温保存设备：层析降温仪，液氮装置。9抽滤装置和水纯化装置。　　　　10角膜内皮分析仪。　　　　11计算机。二、组织培养和保存：(一)、组织培养的基本概念： 把体内的细胞、组织和器官放在类似体内的体外环境中，可使其存活、生长、繁殖或传代。借以观察研究其生长发育、细胞形态和功能，从血分机研究某些疾病的发病机制。严格地说来，组织培养又可分细胞培养、组织培养和器官培养。1．细胞培养(cell culture) 是将机体内的组织取出分散(机械或酶消化)成为单个细胞，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制(contactimhibition)以及细胞衰老过程等生命现象。在细胞培养中，细胞不再形成组织。2．组织培养(tissue culture) 指组织在体外条件下维持生长，组织仍可分化并维持其结构和／或功能。需要说明的是，进行组织培养时，不论采用什么方法和条件，被培养组织的主要成分仍然是细胞；细胞在生长过程中总有移动和其他变化，这将使得培养的组织难以长期维持其特有的结构和功能。培养时间越长，发牛变动的可能性就越大。结果，常使单一类型的细胞保存下来，最终也成了细胞培养。另外，所谓细胞并不意味着细胞彼此是独立的，细胞之间仍然相互依存，呈现一定组织的特性。所以，组织培养和细胞培养并无严格区别，两者在一定程度上可看作是同义语。3．器官培养(organ culture) 指器官为原基、整个器官或器官的一部分，在体外条件下维持生长或分化并保持结构和／或功能。 原代培养或初代培养(Primary culture)，即从体内取出细胞或组织的第一次培养。传代(passage)或再培养(reculture)，即把一瓶培养细胞全部或分成几份接种人另一些培养器皿中。原代培养经首次传代成功后即为细胞系(celllinne)。具有无限繁殖能力和能反复进行传代的细胞系，即为连续或无限细胞系(continuous cell line)，又称为已建细胞系(estabilshed cell line)。体外(in vitro)培养是在体外进行的生物过程的实验，现在常与组织培养一词通用，与体内(in vivo)相对。（二）、组织培养的基本条件： 在体外培养细胞必须能够维持和模拟细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程，为此必须提供必需的营养、适宜的pH、严格的无菌条件、渗透压、培养器皿、温度和二氧化碳等条件。1培养基： 目前广泛使用的培养基是化学合成培养基：其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质； （1）．氨基酸(amino acid) 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。所有细胞都需要酪氨酸、组氨酸、赖氢酸、精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等12种氨基酸。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺。谷氨酰胺具有特殊的作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。 （2）．维生素(vitamins) 是维持细胞生长的一种生物活性物质，它在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。其中脂溶性维生素(A、D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。维生素C也是不可缺少的，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。 （3）．无机离子(ion) 细胞的生长，除了需要钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素以及碳酸氢盐和磷酸氢盐等以外，还需要铁、铜、锌等微量元素。这对调节细胞渗透压、某些酶的活性以及溶液的酸碱度都是必须的。（4）．碳水化合物(carbohydrate) 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。（5）．激素和生长因子(hormone and growth factor) 。（6）．其他成分 在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A。2、气体和pH值： 气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。 一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中培养。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的