上海交通大学微生物实验课件实验八质粒提取讲解.ppt

实验报告 实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 p106(1),(2), (4) 下次实验 质粒DNA的电泳、病毒的检测（血凝和血凝抑制试验） 实验八 质粒提取、病毒培养 实验目的 理解碱裂解法制备质粒DNA的原理 掌握提取质粒DNA的方法 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握DNA电泳操作及DNA分子量大小的测定 一、质粒的一般生物学特性 质粒(plasmid)是独立于细菌染色体以外的能自我复制的环状闭合的双股DNA，质粒DNA一般为细菌染色体的3%左右, 作为基因克隆质粒载体的所有质粒DNA分子都必定包括如下三个共同的组成部分: 复制基因、选择标志基因和克隆位点。 质粒广泛存在于细菌细胞中, 此外在霉菌、蓝藻、酵母和某些动植物细胞中也发现有质粒存在。 大肠杆菌乳糖操纵子简介： I: 调节基因 P: 启动子 O: 操纵基因 Z、Y、A: 结构基因, 其中Z编码 β-半乳糖甘酶( β-galactosidase), Y 编码透性酶 ( permease) , A 编码乙酰基转移酶( acetylase). I P O Z Y A Ori:复制子． ＭＣＳ：multiple cloning sites,多克隆位点． 二、碱裂解法制备质粒DNA注意点：使用酚－氯仿时注意安全 三、琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）注意点：制、看胶时，戴一次性手套，注意ＥＢ（溴化乙錠） 碱裂解法制备质粒DNA（书上的原理不完全正确） 染色体DNA分子大，易断裂乘线型DNA分子 质粒DNA 共价闭合环型 在碱性环境中线型的染色体DNA和环型的质粒DNA氢键发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA只部分发生断裂，两条互补链不会完全分离。 当pH调至中性并在高盐浓度存在的条件下，已分开的染色体DNA互补链不能复性，交联形成不溶性网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来。 部分变性的质粒DNA在中性环境中很快复性，呈可溶状态保存在溶液中，离心后，存在上清中。 再通过酚、氯仿、乙醇沉淀，获得纯的DNA  溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸； 溶液Ⅵ：酚：氯仿：异丙醇＝25：24：1 所用溶液 质粒的提取 p143 （1）新鲜培养含有质粒的细菌 （2）取1ml 培养物加入1.5ml离心管中，10000rpm离心2 min。 （3）倒掉上清，尽可能倒干净。 （4）细菌沉淀重悬于100ul的溶液Ｉ中，用 移液枪吹打至均匀。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散(三种成分各发挥什么作用？）。 操作程序 （5）加200μl新配制的溶液Ⅱ（问什么现配现用？怎样发挥作用的？严格控制时间，为什么？） 盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。于室温放置２-3分钟至液体清亮。 （6）加150μl的溶液Ⅲ (2种成分发挥怎样的作用？仔细观察，发生了什么现象？） 盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅲ接触。 （7）4℃10000rpm离心10分种，立即将上清（400-450μl）转移到另一离心管中。不要带入沉淀，如有则用枪头挑出。 操作程序 （8）加等体积的溶液Ⅵ，振荡、颠倒离心管几次以沉淀DNA，于室温放置２分钟，小心吸取上层水相至另一洁净的离心管中（为什么要用这3种试剂？）。 （9）加入2倍体积的冷的无水乙醇，室温放置２分钟，10000rpm 5min，在管底可见微量的DNA沉淀，小心吸弃上清液。 （（10）加入1ml70%乙醇，将DNA沉淀悬浮起来后，4℃10000rpm离心５分钟。 （（11）小心吸弃上清液，将离心管倒置于一张纸巾上以吸尽液体。在室温干燥10分钟。 （（12）取30μl灭菌水，用枪头吹达沉淀，使其彻底溶解，取9μl的DNA样品进行琼脂糖电泳，其余-20℃保存备用。 电泳准备 用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1×TAE–buffer)，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至60℃，加入适量溴化乙锭至微红，混匀。 将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在5-7mm之间。 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×TAE–buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳