基因工程作业.doc

1.比较克隆载体和表达载体的异同点？ 同：1）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞；2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3）具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；4）具有合适的筛选标记。 异：1）表达载体在克隆载体的基础上又增加了基因表达的调控元件：即启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号（区分二者的标志）2）克隆载体在菌体中一般是多拷贝的，而表达载体一般是低拷贝的。 2.什么是限制性内切酶？ 能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA双链的核酸内切酶。 生物学功能：1，保护自身的DNA分子，不受限制（修饰的甲基转移酶）； 2，抵御“外来”DNA分子的入侵，迅速使之降解（核酸内切限制酶）。 类型：I型酶（无用）、II型酶（常用工具酶）、III型酶（用处不大） 其中，II型酶基本特性：1，在DNA分子双链的特异序列识别并切割导致链的断裂； 2，两条链断裂的部位在DNA分子上的分布，通常不是直接相对的，因而会形成互补的链延伸末端。少数酶切割后产生平末端。 3.载体具有哪些基本特性？ 1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)； 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点； 3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点； 4.具有较高的外源DNA的载装能力； 5.具有合适的筛选标记。 4.PCR的反应步骤及原理？ 答：基本原理：PCR技术是以DNA互补链的聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸,最终获得特异DNA片段的体外扩增方法。 步骤：变性：系统加热至92℃-96℃，使dsDNA解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质； 退火：降温至37℃-72℃，使引物与模板的互补区相结合； 延伸：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA。 这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。 5.抑制性差减杂交的原理与应用？ SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；抑制性PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。 6.基因文库的基本条件，构建步骤？ 基本条件：1.重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力； 2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序； 4.克隆片段易于从载体分子上完整卸下； 5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选； 6.具有较高的完备性。 构建步骤：1.基因组DNA的制备：为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂； 2. 基因组DNA的切割：用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；第二，保证DNA片段大小均一。 3. 载体和受体的选择：出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ-DNA或考斯质粒； 4. 基因文库构建的技术性问题：在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：避免外源DNA片段之间的连接。 7.α互补？ 宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫(互补 在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有B－半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码序列；在这一编码区中插入有一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶的氨基端，而不影响功能；宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。 由α互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTG的存在下可与生色底物X-gal反应，因此Lac＋细菌在含X-gal和IPTG的培养基上可形成蓝色菌落，易于识别。当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无α互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 8.基因重组的步骤？ 1.目的基因的获取(获取目的基因是实施基因工程的第一步。)目的基因来源可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成，获取目的基因的方法: ①从基因文库中获取(基因组文库，部分基因文库)； ②利