基因工程作业.docx

一、RNA提取与检测：1、原理：采用Trizol法提取总RNA2、试剂及作用:（1）TRIZOL：是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。（2）DEPC：中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，常用于生物实验中RNA的提取等。（3）氯仿：一般指三氯甲烷，遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气（碳酰氯）和氯化氢。常加入0.6%～1%的乙醇作稳定剂。氯仿在实验中虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。（4）异丙醇：一种有机化合物，正丙醇的同分异构体，别名二甲基甲醇、2-丙醇，异丙醇的作用是在氯仿作用后使RNA沉降下来形成，加入后离心管中会产生沉淀。其优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带可能会不清楚。缺点是加入后难以挥发。（5）75%乙醇：作用是清洗沉淀下来的RNA（6）DEPC处理过的水：用于处理实验过程中的用具，防止RNA降解，另外最后一步中用于溶解RNA。3、注意：(1)整个实验过程中都要戴手套，口罩，最好在冰上进行操作，严防外界RNA酶降解RNA。(2)液氮研磨时，应使用预冷的研钵，植物材料应剪碎，加入液氮后待研钵中再无气泡冒出后迅速研磨，一定要研磨充分。(3)提取的总RNA应保存在-20摄氏度的冰箱。4、提取的总RNA检测：提取的总RNA可通过琼脂糖凝胶电泳做检测，如果电泳显示4条带即28S，18S，5.8S,5S的RNA条带，四条带完整且28S的条带亮度是18S的两倍，则认为提取RNA质量较好，若有弥散条纹出现，则RNA部分降解。另外还可以用核酸测定仪对提取的总RNA进行含量测定。二、RT-PCR及电泳：1、原理：RT-PCR即反转录PCR，是以反转录的mRNA做模板进行的PCR反应.原理是利用反转录酶，mRNA模板，特异引物，dNTP等反转录得到目的基因的cDNA第一链，然后扩增得到目的cDNA。PCR反应步骤：（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。（3）引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的链。PCR引物的选择：（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。（2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。（3）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3’末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。2、试剂及作用：(1)mRNA模板：反转录的模板(2)oligo(dT): oligo多聚体,用于反转录，绝大多数mRNA3’端有poly(A)尾巴，oligo与其相配对，其作用相当于mRNA引物。(3)M-MULV反转录酶: 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶。(4) dNTP：脱氧核苷酸(5)PCR特异引物：引物 GAPDH1-1，GAPDH1-2可以扩增目的基因。(6)反转录缓冲液：提供缓冲体系(7)Taq DNA聚合酶：合成cDNA第二链3、注意：(1)PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。(2) 双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。(3) 复性过程采用的温度至关重要如果