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基因工程复习题2015年 5 月 14号 江山 整理 基因工程复习资料绪论 基因工程 是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传形状的操作。基因工程流程：（1）目的基因克隆 （2）载体的准备 （3）目的基因与载体连接 （4）重组DNA的转化/转染/转导 （5）重组体的筛选与鉴定 （6）重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用基因工程的酶学基础限制性内切核酸酶的类型：特性 Ⅰ 型 Ⅱ型限制和修饰活性 双功能酶 内切核酸酶和甲基转移酶分开酶蛋白分子组成 3种不同亚基 单一亚基限制作用所需辅 ATP、Mg2+、S-腺苷 镁离子助因子 甲硫氨酸 特异性识别位点 非对称序列 回文对称结构切割位点 在识别位点至1kb识别位点上 处随机切割 序列特异性切割 否 是甲基化作用位点 寄主特异性位点 寄主特异性位点识别未甲基化序 能 能列并切割分子克隆中应用 无 广泛Ⅰ 型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近切割，切割是随机的Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别序列的固定位置上切割双链DNA分子。（分子剪刀）2.Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性 （1）识别序列的特异性 识别长度为4——6bp,双重旋转对称结构的回文序列 （2）切割位点的特异性 ①.DNA 分子酶切片段的末端 A黏性末端 DNA 分子在酶切后形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构 B 平末端 若限制性内切酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端为平末端。 ②同切点酶 又称同裂酶，是一类来源不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切酶。 ③同尾酶 来源各异，识别序列页各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端3.影响限制性内切酶活性的因素：答：（1）酶的纯度 （2）DNA样品纯度 （3）DNA甲基化程度 （4）酶切反应温度 （5）DNA分子的构型 （6）反应缓冲液 （7）酶的星号活性4. DNA连接酶的发现 答：DNA连接酶是能催化双链DNA片段靠在一起的3?羟基末端与5?端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两端连接的一种酶。 依据反应时所需能量辅助因子的不同分为两类：一类是依赖ATP的DNA连接酶； 另一类是依赖NAD+的DNA连接酶。依据其来源可分为三类： T4噬菌体DNA连接酶 、 大肠杆菌DNA连接酶（75kb 肽链）、 热稳定DNA连接酶。5. DNA连接酶特点T4DNA连接酶是由487个氨基酸组成的多肽单体大肠杆菌DNA连接酶是一条相对分子质量为75000的多肽链，由lig编码.DNA连接酶催化的连接反应特点是：6. DNA连接酶的作用机理答：DNA连接酶是利用ATP或NAD+提供的能量催化DNA双链间缺口形成磷酸二脂键，连接反应的机理如下 在连接反应中，首先ATP（NAD+）与DNA连接酶反应，与连接酶生成一种一种共价结合的酶-AMP复合物。其中，AMP通过一种磷酸酰胺键与DNA连接酶的赖氨酸残基的ε-氨基相连，同时释放ppi或烟酰单核苷酸。AMP激活DNA一条链的5?末端磷酸基团并转移到磷酸基团上，形成DNA——腺苷一磷酸复合物。最后，3?-OH对激活的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。在行成酶—腺苷酸复合体时，焦磷酸水解和释放提供的能量驱动连接反应，因此在以ATP作为能源的连接酶中，一个磷酸二脂键的形成消耗两个高能磷酸键。7.影响连接反应的因素答：反应温度：黏性末端一般为4-15℃，平末端为10-20℃。 ? 连接酶浓度：平末端连接的最适酶量约为1-2个Weiss单位 (P24)，而黏性末端在同样条件只要0.1个单位，连接时间为 16℃、4h或4℃过夜。 ? ATP浓度：最适终浓度一般为0.5mmol/L。 ? DNA片段末端：插入片段与载体的浓度比例为10-20，增加插 入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。8. DNA聚合酶是指在引物和模板的存在下，将dNTP连续地加到双链DNA分子 引物链的3’-OH末端，催化核苷酸聚合作用的酶。类型：依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。9.(一)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ P25-26 E.coli 3种类型的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ(DNA PolⅠ)、 DNA聚合酶Ⅱ(DNA PolⅡ) 、DNA聚合酶Ⅲ(DNA PolⅢ) ? DNA聚合酶Ⅰ是A. Kornberg等于1956年首次在E.coli 中发现 的，它是由polA基因编码的一种单链多肽蛋白质。10.Klenow片段 P27E.coli DNA聚合酶Ⅰ被蛋白酶切割成两个大小不 同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片 段具5’→3’聚合酶活