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胡萝卜愈伤组织培养及继代培养
本科学生综合性实验报告
学号: 104120265 姓 名: 段昌福
学院: 生命科学学院 专业、班级:10应用生物教育B班
实验课程名称:胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
教 师: 杨 世 忠
开 课 学 期: 2013 至 2014 学年 第二 学期
填 报 时 间: 2013 年 6 月 日
云南师范大学教务处编印
实验序号 实验二 实验名称 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验 实验时间 2013年3月-6月 实验室 组培实验室 (一)、实验目的
1.熟练掌握配制与保存培养基母液的基本技能。
2.熟练掌握培养基配制的基本技能,并能根据实验目的设计适合的培养基配方。
3.学会设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。
4.熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。
5.掌握组培室常用的化学试剂。
6.学会设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。
7.熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。
8.使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术,进一步熟悉、规范无菌操作技术。
9. ?使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。 (二)、实验原理、实验流程或装置示意图
1、实验原理
(1)配制培养基时,为了使用方便和用量准确,通常采用母液法进行配制,即将所选培养基配方中各试剂的用量,扩大若干倍后再准确称量,分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存,使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。
(2)愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤刺激后,在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成,可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分,愈伤组织可帮助伤口愈合;在嫁接中,可促使砧木与接穗愈合,并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通;在扦插中,从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽,迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时,条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是:外植体中的活细胞经诱导,恢复其潜在的全能性,转变为分生细胞,继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。愈伤组织的生长是发物对离子的吸收,因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。此外,PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以,当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。培养基若偏酸时用氢氧化钠 (1mol·L-1)来调节,若过碱就用盐酸 (1mol·L-1)来调整。当PH值高于6.0时,培养基将会变硬;当PH值低于5.0时5.0时,琼脂不能很好地凝固。
(4)植物组织培养的优点:
① 研究材料来源单一,无性系遗传背景一致;
② 经济方便效率高;
③ 条件可控误差小;
④ 生长快周期短重复性强;
⑤ 可周年试验或生产。
(5)组织培养实验室布局的总体要求:
便于隔离,便于操作,便于灭菌,便于观察。
(6)组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。
常用的物理方法有:
物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。
常用的化学方法: 消毒剂、抗菌素灭菌。
不同物品要选用不同的灭菌方法。
实验室中常用仪器设备及其灭菌方法如下:
①培养基灭菌:高温高压湿热灭菌法。具体方法如下: 压力在9.8×104—10.8×104Pa,温度在121℃,灭菌20—30min。
②玻璃器皿灭菌:蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌
③塑料器皿灭菌:多采用高压蒸汽消毒灭菌
④金属用具灭菌:灼烧灭菌。具体方法是:浸入95%酒精,后置于酒精火焰上灼烧,冷却后使用。
⑤接种室灭菌:紫外灯照射、空气消毒灭菌。
超净工作台:紫外灯照射,70%—75%的酒精擦洗。
⑥外植体灭菌:
水冲洗10—20min或更长时间 70%—75%酒精中浸泡30s 0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右 蒸馏水冲洗4—5次 备用。
2、实验流程
(1)实验总体流程:
(2)无菌操作流程:
胡萝卜愈伤组织诱导培养流程:
(4)胡萝卜愈伤组织的继代培养流程:
(三)、实验设备及材料
1、实验材料
新鲜的胡萝卜贮藏根
2、实验设备
(1)配制MS母液培养基所需的仪器设备和药品:
①仪器设备:
电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉、量筒。
②药品:
NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、 MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、Mn
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