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补体结合试验
第二节 补体结合试验 补体结合试验(complementfixationtest,cft)是用免疫溶血机制做指示系统,来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断,即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进,除了用于传染病诊断和流行病学调查以外,在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。
一、类型及原理自身免疫性溶血,如果有补体参与时,补体通过一系列的激活,最后形成 膜攻击复合物(membrane attack complex),它可以直接攻击红细胞膜,导致红细胞破裂,这就是所谓“血管内溶血”。而没有补体参与的免疫性溶血,抗体与红细胞膜上抗原结合后,没有直接把红细胞破坏,而是把红细胞“致敏”,致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时,被吞噬细胞“吃掉”,这就是所谓“血管外溶血”。
该试验中有5种成分参与反应,分属于3个系统:①反应系统,即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原);②补体系统;③指示系统,即srbc与相应溶血素,试验时常将其预先结合在一起,形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统,先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
如果反应系统中存在待测的抗体(或抗原),则抗原抗体发生反应后可结合补体;再加入指示系统时,由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血,是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体(或抗原),则在液体中仍有游离的补体存在,当加入指示系统时会出现溶血,是为补体结合试验阴性(图14-2)。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体,或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图
二、试验方法
补体结合试验的改良方法较多,较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法(塑板法)等。目前以后两种方法应用较为广泛,因为可以节省抗原,血清标本用量较少,特异性也较好。以下叙述以小量法为例,即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml,补体加0.2ml,总量为0.6ml。
(一)试剂
1.抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯,纯度愈高,特异性愈强。如使用粗制抗原时,须经同样处理的正常组织作抗原对照,以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2.抗原和抗本的滴定补体结合试验中,抗原与抗体按一定比例结合,因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定,选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应(100%不溶血)的最高稀释度作为抗原和抗体的效价(单价)。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原,配加不同稀释度的抗血清,另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统,温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中,抗原一般采用2~4个单位(1:64~1:32),抗体采用4个单位(1:8)。
表14-4抗原和抗体的方阵滴定
抗原
抗血清稀释倍数
抗原对照
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512
1:4
4
4
4
4
4
4
3
2
0
1:8
4
4
4
4
4
3
2
1
0
1:16
4
4
4
4
3
2
2
±
0
1:32
4
4
4
4
3
1
±
0
0
1:64
4
4
4
④
2
±
0
0
0
1:128
4
2
1
0
0
0
0
0
0
1:256
3
1
0
0
0
0
0
0
0
1:512
0
0
0
0
0
0
0
0
0
抗体对照
0
0
0
0
0
0
0
0
?
注:1、2、3、4分别表示溶血反应强度+、++、+++、++++;0为不溶血。
3.补体滴定按表14-5逐步加入各试剂,温育后观察最少量补体能产生完全溶血者,确定为1个实用单位,正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血,按比例公式0.12×2:60=0.2:x计算,x=50;即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。
表14-5补体的滴定
管号
1:60补体(ml)
缓冲液(ml)
稀释抗原(ml)
?
致敏srbc
(ml)
?
结果
1
0.04
0.26
0.1
放
置
37℃水
浴30min
0.2
放
置
37℃水
浴30min
不溶血
2
0.06
0.24
0.1
0.2
不溶血
3
0.08
0.22
0.1
0.2
微溶血
4
0.10
0.20
0.1
0.2
微溶血
5
0.12
0.18
0.1
0.2
全溶血
6
0.14
0.16
0.1
0.2
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