超高效液相色谱(uplc).doc

超高效液相色谱(UPLCTM)：重新定义液相色谱 分离科学的能力随着首次成功地使用小颗粒得到惊人的分离能力而进入了一个新的时空。这个新的色谱领域，所谓超高效液相色谱（UPLCTM），与传统的HPLC技术相比提供了更高的效率，因而具有更强的分离能力。作为世界第一个商品化UPLCTM产品的Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱系统，利用创新技术进行整体设计，大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度。UPLCTM的商品化，是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱亦由此进入了全新的时代。 基于1.7 μm小颗粒技术的UPLCTM，与人们熟知的HPLC技术具有相同的分离原理。不同的是：UPLCTM不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。使用UPLCTM可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。 小颗粒分离的理论与科学基础 液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。 事实上，上述规律的理论基础是著名的范德米特(van Deemeter)方程――这是全世界所有从事色谱研究的科学家熟知的理论。由此得到的范德米特(van Deemeter)曲线，亦是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。该曲线预测最佳柱效与相应的流动相流速。 由曲线得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了，这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来优化流速（分析速度）。 小颗粒为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。然而HPLC系统的设计，一直苦于难于发挥出最小颗粒的优点。小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统体积要更小以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。 Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色谱系统的设计，充分利用了小颗粒的所有优点，弥补传统HPLC系统的不足。由于把全局设计思路用于所有集成的部件，包括从进样到数据采集——Waters UPLCTM系统展示了一种设计理念，在当今市场上给分离科学赋予了新的含义。 超高分离度 色谱工作者正面临分离十分复杂混合物的挑战，如肽的消解产物、杂质及体内代谢物样品等。为了使分离能完全优化就需要一个超高性能的色谱系统。这样一个系统理想地应符合液相柱色谱的基本原理。 根据等度液相色谱分离的分离度(Rs)方程，分离度(Rs)与柱效(N)的平方根成正比。 ……………(1) 按Van Deemter色谱理论，柱效(N)与颗粒度(dp)成反比： …………(2) 故：随着dp的降低，N值会增加；而N值增加，则Rs值增加。HPLC与UPLCTM的基本分离理论，进一步说明了颗粒度大小和分离度密不可分的关系。 ACQUITY UPLCTM系统发挥了1.7 μm颗粒提供柱效增高的全部优越性。尤其是1.7 μm颗粒提供的柱效比5 μm颗粒提高了3倍。因为分离度与粒度的平方根成反比，1.7 μm颗粒的分离度比5 μm颗粒提高了70％。在梯度分离中也具有同样的优越性，此时分离能力用峰容量衡量。 UPLCTM用1.7 μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰，从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。 由上图可见：UPLCTM可以大大提高分离度，同时色谱峰强度也得到了提高。 超高速度 高通量实验室始终要求在单位时间内提供更多的信息和处理更多的样品并保证提供高质量的数据。 较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。因为颗粒度减小后，柱长可以按比例缩短而保持柱效不变(见式3)，而且Van Deemter理论表明最佳流速与粒度成反比(见式4)。柱长缩短会加快分离速度，而颗粒度越小，最佳流速也越大，进而可以通过提高流速来进一步加快分离速度。 ……（3） 由于ACQUITY UPLCTM系统用1.7 μm颗粒，柱长可以比用5 μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。 UPLCTM的快速分析亦节省了以往一向耗时的方法认证的时间，使方法认证的变得简单快速。用户不必担心因HPLC转换成UPLCTM带来的方法认证负担。 超高灵敏度 过去几年中，提高灵敏度的工作集中在检测器上，包括光学检测器和质谱检