酪氨酸酶的提取及其催化活性研究.doc

酪氨酸特性及其影响因素 酶是具有催化作用的蛋白质。其活性仅决定于它。酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点： 酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构，以提供反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活，所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的。 2、酶促反应所需的活化能较低。如使1mol 蔗糖水解所需活化能高1.34MJ，用H+离子作催化剂时活化能降至87.9 KJ，若用蔗糖酶催化时只需39.4 KJ。 108 ~1020倍，比一般非生物催化剂高107~1013倍。 酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性，每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用，这是一般非生物陈化剂所无法比拟的。 影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度和抑制剂等。在酶浓度恒定的情况下，增加底物的浓度，可以提高酶促反应的初速度。当底物浓度增至某一限度后，反应初速度就不再随底物的浓度而变化，而是逐渐趋近某一极限值，这个极限值称为最大速度(V max)。 Cu+ 或Cu2+为辅助因子的全酶，能催化空气中的氧对多巴的氧化反应。催化过程可以通过多巴转换反应过程的颜色变化来监测，通过测定吸光度随时间的变化来求的酶的活性。 酪氨酸酶可用比色法测定。由于多巴转变成多巴红速率很快，在转到下一步产率慢得多，故可在酶存在下，测定多巴转变为多巴红的速率而测定酶的活性。（可用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性）。 酶参与的多巴转换反应如下： 酪氨酸——多巴——多巴醌——无色——多巴红——二羟基吲哚——吲哚醌——黑色素 酶的活性计算： 一般pH、离子强度），25℃时在 1min内转化1 mol底物所需要的量为酶的活性单位。通过下式可计算出所用的酶的活性：，式中：a为所用溶液的酶的活性， 为最大吸收处吸光度的变化，t为时间，k为酪氨酸的摩尔吸收系数，V为加入的酶体积。 进而计算出所用原料中的酶的活性： ，式中：为原料中酶的活性，为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。 本实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并测定其活性，使我们对酶有个基本认识。当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时，在空气作用下，很快变为棕色，这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。 四、仪器和试剂 1、仪器：分光光度计、离心机、电子天平、研钵、水浴、容量瓶、秒表。 2、试剂：酪氨酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、新鲜土豆。 五、实验步骤及数据记录 1、溶液配制 1.1 酪氨酸溶液的配制 酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小，因而配制过程中需加入一定量盐酸溶解。首先称取一定量的酪氨酸配制0.1mol/L酪氨酸储备液，在实验过程中稀释至0.02mol/L，使用时需要加入一定量的NaOH调节其pH接近中性。 1.2 缓冲溶液的配置 首先分别配置0.2mol/L KH2PO4溶液0.2mol/L NaOH溶液，然后以一定的体积比配置pH=6.0和pH=7.2的KH2PO4-NaOH缓冲溶液。体积比如下表： 表1.1 KH2PO4-NaOH缓冲溶液的体积比 pH KH2PO4与NaOH的体积比 6.0 5∶0.570 7.2 5∶3.500 2、酶的提取 取新鲜土豆，清洁后切碎，称取10.05g置于研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压和研碎，用两层纱布滤出提取液，立即高心分离5min，倾出上层清液保存于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。 3、酪氨酸最大吸收波长确定 取2.5mL酶提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释至10mL比色管中，摇匀。取0.4mL已稀释过的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的缓冲溶液，加入2.0mL酪氨酸溶液，摇匀。反应约数分钟后，于分光光度计上扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图。 表1.2 最大吸收波长的确定 波长（nm） 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 吸光度 0.497 0.509 0.532 0.560 0.585 0.590 0.565 0.550 0.546 0.550 0.551 吸收光谱的绘制如下： 图1.1 酪氨酸吸收光谱的绘制 由图1.1可知酪氨酸的最大吸收波长为450nm。 4、酶活性测量 分别取0.3、0.4、0.5mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入5.0mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入4.0mL酪氨酸溶液，同时开始计时，用分光光度计在450nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。 表1.3 不同酶含