酵母双杂交操作步骤(中文翻译).doc

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素氨苄西林20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物 20 g/L 琼脂（只有制作平板才用） 20 g/L 葡萄糖 (即2%) 1x YPDA培养基(1000 ml) 20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物 0.03 g/L 腺嘌呤 （即终浓度为0.003％20 g/L 葡萄糖 (即2%) 实际配制的方法是： 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用） 配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压） （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121℃高压15min。 注意： 高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。 可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。 需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。（kanamycin可以20℃贮存一个月，加入到平板中去可以4℃贮存一个月。） PEG/LiAc溶液（即配即用） 用下列贮存液来配制 50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例） 终浓度 为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质 PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEG TE buffer 1X 1 ml of 10X TE LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc 无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释） 10x TE buffer : 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压) 10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压 For β-galactosidase 滤膜实验 Z buffer溶液： Na2HPO4? 7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4? 14H2O 则 20.739 g/L） NaH2PO4? H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4? 2H2O 则 6. 21g/L） KCl 0.75 g/L MgSO4 ? 7H2O 0.246 g/L 最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年 X-gal 溶液： X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存 Z buffer/X-gal 溶液： 100 ml Z buffer 0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇1.67 ml X-gal 贮存液 ONPG 溶液：（即配即用） ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0. 注意： ONPG需要1～2h才能溶解 每次用之前新鲜制备。 带有β-巯基乙醇的Z buffer 将0.27 mlβ-巯基乙醇Z buffer中即可 为了转化成功的小提示： 1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。） 2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。 3.当通过离心收集细胞的时候，