实验三免疫印迹.doc

Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 1. 背景 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blotting相似，故命名为Northern blotting。George Stark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。1981年，在Neal Burnette所著的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western blotting。此后开发的Eastern blotting是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern blotting。30年来， Western blotting技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在样品当中，蛋白质的表达情况（上调或下调表达）和不同的样品之间的表达差异性。 pET系统是在E. coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。 2. 实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 3. 实验原理 黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate +?O2??a Flavonol + succinate + CO2?+ H2O。 本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn ?酶切位点，去掉终止密码并引入BamH ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 × His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 × His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中应用广泛。 4. 操作步骤 4.1 样品的制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 4.1.1材料与试剂： 重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)、LB固体培养基（Kan 50μg/mL）、LB 液体培养基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS缓冲液、5 X SDS