微生物生理.doc

实验一　酵母菌细胞超声波破碎 1．实验目的 掌握超声波破碎的原理和方法；了解细胞破碎程度的测定 2．实验原理 超声波是指频率超过人耳可听范围（16－21kHz）的波，即频率为20 kHz以上的波。微生物细胞在超声波的作用下，细胞结构受到破坏，而使细胞破碎。超声波进行细胞破碎的效果与微生物的种类、浓度、超声波频率、输出功率和破碎时间有密切关系。 3．试剂与材料　 （1）超声波细胞破碎仪、水浴恒温振荡器、离心机、冰浴。 （2）细胞破碎液缓冲液：10mmol/L，pH7.4Tris-HCl缓冲液中含5mmol/LMgCl2。 （3）细胞悬浮液：取50－100ml酿酒酵母培养液，5000rpm，离心15min，湿细胞悬浮液于20ml细胞缓冲液中。 4．实验操作 （1）细胞培养与收集：将活化菌种接入细菌培养基中振荡培养，当达到对数生长期后，用离心机收集细胞，5000rpm，离心15min。 （2）细胞破碎：湿细胞悬浮液于20ml细胞缓冲液中。用20 kHz频率，150功率，在冰浴中进行超声波细胞破碎，破碎5min。 （3）结果观察， ①用离心机在8000rpm条件下离心5min，除去未破碎细胞，上清液为溶胞液，含有胞内各种成分，可通过测定胞内成分变化确定破碎率。 ②对细胞破碎液染色制片进行观察，确定细胞破碎程度。 实验二 无细胞制剂的酒精发酵的实验 一、实验目的 1、掌握超声波粉碎仪的使用方法 2、了解无细胞制剂的发酵原理 二、实验原理 在无细胞存在的情况下，酒化酶将糖发酵成酒精。 三、实验材料 啤酒酵母 四、实验方法与步骤 1、酵母菌液的制备 液体培养 2、酵母细胞的破碎 将菌液倒入小烧杯——超声波粉碎仪粉碎10min（注意5min换一组）——抽滤——细菌滤膜过滤除菌，以达到无细胞的目的 3、装瓶 五组分别装适量的无细胞抽滤液——用18％的葡萄糖加满——培养（30－32℃，36h）——观察 五、注意事项 1、超声波粉碎仪的使用时间不可过长，温度升高会使酶失活。 2、真空抽气泵的使用 3、细菌滤膜的使用 实验三　酵母菌细胞的固定化酒精发酵 一、目的要求了解固定化酶及微生物细胞固定化的原理及其优缺点。掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。海藻酸钠凝胶固定化细胞的制备海藻酸钠凝胶是从海藻中提取获得的藻酸盐，为D- 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子如Ca2 、Al3 可诱导凝胶形成。将微生物细胞与海藻酸钠溶液混匀后，通过注射器针头或相似的滴注器将上述混合液滴入CaCl2 溶液中，Ca2从外部扩散进入海藻酸钠与细胞混合液珠内，使藻酸钠转变为水不溶的藻酸钙凝胶，由此将微生物细胞包埋在其中。在此法的使用中，应尽量避免培养基中含有钙螯合剂（如磷酸根），因为它可导致钙的溶解和释放，并由此引起凝胶的破坏。　三、实验材料（一）菌种　　酿酒酵母。（）主要药品海藻酸钠、琼脂葡萄糖。四、实验内容（一）酵母种子培养液的制备挑取新鲜斜面菌种一环，接入装有 0 ml 酵母菌培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养，共接 瓶，培养至对数期。（二）细胞的固定化海藻酸钠称取1.6g海藻酸钠于无菌的小烧杯中，加无菌去离子水少许，调成糊状，再加入其余的水（总量为 40 ml）。火上加温至熔化，冷却至 45℃左右加入 10 ml酵母培养液，混合均匀，倒入一个无菌的小塑料瓶中或注射器外套并与针头相连，通过 1.5～2.0 mm的小孔，以恒定的速度滴到盛有 10％CaCl2 （胶诱导剂）溶液的平皿中制成凝胶珠。用无菌去离子水洗涤三次后加入 葡萄糖，置 30℃培养 72h测定酒精含量。 学习酒精沉淀法提取酶制剂的原理，掌握酒精沉淀法提取糖化酶的方法。 2．实验原理 酶的提取首先要除去发酵液的悬浮固形物，获得澄清的酶液；然后进行适当程度的浓缩；其次根据需要将酶沉淀，然后收集沉淀、干燥、磨粉、获得粉状制剂。黑曲霉糖化酶是一种胞外酶，因 此，首先采用过滤法将菌体等杂质除去，继而对滤液进行浓缩，最后将酶沉淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。糖化酶的沉可采用硫酸铵盐析法，也可采用有机溶剂如乙醇沉淀的方法。 3．实验材料与仪器 糖化酶发酵液，盐酸，无水酒精，布式漏斗，滤布，旋转式蒸发器，干燥箱，天平，三角瓶，量筒等。 4．实验步骤 （1）过滤：取发酵液 250ml，在漏斗中用滤布过滤除去菌体。 （2）浓缩和沉淀：将总滤液放人蒸发器中浓缩到1/3－1/5体积，用盐酸调节PH到3．5， 在10－20℃条件下加