肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率分析报告.doc

肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率 【摘要】 目的： 探讨胃癌细胞抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导T淋巴细胞 (T lymphocyte) 增殖和杀伤胃癌细胞的效率. 方法： 应用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞，经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）、重组人白细胞介素4（rhIL4）和肿瘤坏死因子α（TNFα），体外诱导培养获取成熟DC，流式细胞术检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表型；同时经重组人白细胞介素2（rhIL2）诱导扩增T淋巴细胞，检测CD3，CD4，CD8及CD56表型. 以人胃癌OCUM2MD3细胞株冻融抗原致敏DC，然后刺激T淋巴细胞，得到肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. MTT法检测致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响和致敏DC活化的特异性CTL对胃癌细胞的体外杀伤效率. 结果：体外诱导人外周血单个核细胞，可获得大量形态典型、具备强烈刺激增殖能力、且高表达CD80，CD86的DC及高表达CD3的T淋巴细胞；MTT法检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC组刺激T淋巴细胞增殖指数显著高于未致敏DC组和对照组(P0.01)；流式细胞术检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC主要刺激T淋巴细胞增殖为CD8+的CTL（60.58±8.43）%，经胃癌细胞抗原致敏DC刺激后，对胃癌细胞的杀伤效应显著增加，致敏DC组对胃癌细胞杀伤活性（71.57±4.83）%，较未致敏DC组（12.53±1.62）%和单纯T淋巴细胞组（10.45±1.40）%作用更为显著（P0.01）,而且随着效靶比增加，其杀伤效应亦显著增加. 结论： 胃癌细胞抗原致敏DC可显著刺激T淋巴细胞增殖为CD8+ CTL，进而发挥其高效杀伤胃癌细胞的作用. 【关键词】 树突细胞；T淋巴细胞；胃肿瘤；T淋巴细胞，细胞毒性 　　0引言 　　树突状细胞（dendritic cells, DC）是专职的抗原提呈细胞，与机体抗肿瘤免疫关系密切［1］. DC加工处理提呈抗原信息后，通过激活T淋巴细胞而发挥抗肿瘤细胞的免疫效应. 研究［2］表明，各种人DC前体细胞如脐血、骨髓及外周血CD34+细胞或CD14+细胞等在联合应用GMCSF，IL4，TNFα等因子体外培养下，均可诱导成为成熟DC. 在多种肿瘤的临床试验中，发现DC免疫治疗具有一定的效果［3］. 我们以人外周血为DC来源，利用胃癌细胞冻融抗原致敏DC，观察其诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphotytes，CTL）对胃癌细胞的杀伤效率，为DC治疗胃癌提供实验依据. 　　1材料和方法 　　1.1材料人胃癌高侵袭OCUM2MD3细胞株，由日本大分医科大学外一科八代正和教授惠赠. 外周血取自健康志愿者. 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF），重组人白细胞介素4（rhIL4），白细胞介素2（rhIL2）和重组人肿瘤坏死因子α（rhTNFα）（美国Cytolab 公司）；抗人CD3PE，CD4PE，CD8PE和CD56PE（美国Becton Dickinson公司）；四甲基偶氮唑蓝（美国Sigma公司）；抗人CD83PC5，CD86PE，CD80FITC和HLADRFITC（美国BECKMAN COUNTER公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1DC分离培养及鉴定应用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,以rhGMCSF和rhIL4诱导培养5 d后，加入TNFα，于第7日收集DC，光镜及电镜下观察其形态. 同时分别加入荧光标记的CD83PC5，CD80FITC，CD86PE和HLADRFITC，间接免疫荧光染色，采用文献［4］的方法，流式细胞仪检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表达. 　　1.2.2胃癌细胞冻融法制备抗原致敏DC胰蛋白酶消化、吹打收集对数生长期的人胃癌OCUM2MD3细胞，调整细胞数为2×107/mL. 将人胃癌OCUM2MD3细胞以液氮反复冻融法［5］ 制备肿瘤抗原. DC培养至第5日加入胃癌细胞抗原，第7日加入TNFα，第8日收获胃癌OCUM2MD3细胞抗原致敏的DC. 　　1.2.3MTT法检测致敏DC诱导T淋巴细胞增殖将胃癌细胞抗原致敏DC,未致敏DC和T淋巴细胞，经60Co照射灭活，分别取1×103，3×103， 1×105接种于96孔培养板，分为致敏DC组、未致敏DC组和T细胞组. 每孔加入1×105 T淋巴细胞，终体积为200 μL. 混合培养96 h后，加入MTT溶液20 μL，继续静置培养4 h后，吸弃培养基，加入DMSO 150 μL，均匀震荡混匀10 min，自动酶标仪于波长492 nm处测定吸光度A值，空