果蝇总蛋白提取和SDS-PAGE.docx

果蝇总蛋白提取和SDS检测摘要：本次实验主要分为两大部分。第一部分是分别以果蝇成虫和幼虫为材料，通过TBS试剂提取果蝇总蛋白，第二部分是通过SDS检测果蝇总蛋白表达，对果蝇的蛋白表达进行了分析。关键字：果蝇；总蛋白；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ1 材料及仪器1.1实验材料果蝇成虫还有幼虫各6-10只，雌雄均等。果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名： Drosophila?melanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。1.2??试剂及仪器?1.2.1??试剂TBS缓冲液（20?mM?Tris-HCl，150?mM?NaCl,?pH7.9），蛋白上样缓冲液，染色液，脱色液1.2.2?器材?1.5ml离心管，匀浆棒，高速台式离心机，10μl、200μl及1ml微量移液器及吸头，微波炉，电泳仪，电泳槽，扫描成像仪，水平摇床等2??实验方法及步骤?2.1总蛋白提取分别取果蝇成虫、幼虫各约5只，加入200μl?TBS缓冲液在匀浆器中匀浆，将匀浆液于4摄氏度条件下1000rpm离心十分钟，取出离心管，吸取上清液4μl，加入16μl蛋白上样缓冲液，沸水浴5分钟。2.1凝胶制备安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。贮存液分离液 ml浓缩胶5%6.5%7.5%10%12.5%15%20%A344.565680.9B4.54.54.54.5333C1.5H2O10.59.597.5430.53.6微波加热10SD0.070.070.070.070.070.070.070.040.0060.010.010.010.010.010.010.010.006A液：丙烯酰胺29.2g Bis0.8g 加水至100ml完全溶解 （配完过滤）B液：1.5M Tris-HCl buffer PH=8.8先将Tris溶于水（18.16）至完全溶解，加水至100ml，在酸度计和磁力加热搅拌器联合作用下，用浓盐酸和稀盐酸调PH=8.8C液：0.5M Tris-HCl buffer PH=6.8 1M HCl 48ml，加Tris5.98g，加水至100mlD液：10%过硫酸铵，4℃可贮存2-3星期电泳缓冲液：10X电极缓冲液，使用时稀释10倍 甘氨酸144g Tris35.3g 加水至一升染色液：考马斯亮蓝1.92g 甲醇227ml 冰醋酸46ml 水227ml脱色液：10%冰醋酸25% 工业酒精制备凝胶板：（已经由老师准备完毕）??（1）分离胶制备：按表配制20ml?10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。??（2）浓缩胶的制备：按表配制10ml?3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3?Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。2.2加样加样前沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。?加样体积为20μL。用微量注射器贴在长玻璃板小心将样品还有Marker通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，可开始电泳。2.3电泳?将直流稳压电泳仪开关打开，电压调节至120V左右。当蓝色染料迁移至底部时，电泳完成，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，将胶板移至大培养皿中染色。?2.4染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。2.5扫描条带用蛋白胶扫描仪扫描条带，得到样张。3??实验结果 1 2 3 4 5 6 7第7条泳道是marker，第5泳道是成虫总蛋白电泳条带，第6泳