氨基酸测定方法.doc

4.1 光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc－HAc缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。 4.1.2标准曲线的确定 分别准确移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 4.1.3样品的测定 稀释待测液于0.24mg/ml—0.73mg/ml,调pH值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 4.1.4 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min，β-氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、缓冲溶液pH=6.00 4.1.5样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=6.00的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3： 表3 样品的测定 Table 3 Determination of sample 待测液序号 待测液所对应的反应时间 吸光度A 1 10h 0.320 2 20h 0.710 3 22h 0.562 4.1.6 浓度对显色反应的影响: 实验表明，β-氨基丙酸与茚三酮水溶液在表3所注的条件反应的最低浓度为0.24mg/ml，随着β-氨基丙酸的浓度变大显色逐渐变深。当浓度大于0.73mg/ml时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。当β-氨基丙酸的浓度在0.24mg/m—0.73mg/ml时，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作为测定范围。得到的数据如表4： 表4 浓度对显色反应的影响 Table 4 Concentration on the color reaction 标准液的浓度(mg/ml) 0.14 0.24 0.60 0.73 0.89 颜色变化 基本无色 浅蓝 蓝 深蓝 蓝紫 吸光度A 0.046 0.400 0.746 1.272 1.120 注：在沸水中加热10min，标准溶液的体积为5ml,加入1ml茚三酮水溶液。 4.1.7 pH值对显色反应的影响[8] 以1.5mg/ ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min,观察到的颜色变化如 表5： 表 5 pH值对显色反应的影响 Table 5 The influence of pH on the color reaction pH值 3.42 5.01 5.16 5.43 5.50 6.00 7.44 9.05 10.30 颜色 无色 浅蓝 浅蓝 蓝 蓝 深蓝 红棕色 红棕色 红棕色 注：在沸水中加热10min，β-氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、缓冲溶液Ph=6.00 显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。当pH值小于3.42时几乎无色，而在pH值在3.78—7.44时颜色变化明显。pH值为6.00，加热不到二分钟即显色；pH值为9.05，加入茚三酮溶液后不加热30s左右即显红棕色；茚三酮水溶液在强碱的条件下带有明显的淡黄色。因此pH值为6.00左右最好。故我选定pH值为6.00。此时显色明显无干扰且稳定。 4.1.8温度和反应时间的影响： 实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。温度太低，反应太慢导致显色时间长，而且显色效果不好。