生物测序技术概述.ppt.ppt

TRINITY原理介绍 Trinity 右图是Trinity软件组装的简单原理。 a 组装Contig b 构建组件信息 c 结合Reads信息构建全长转录本 指一个细胞内基因组DNA转录得到的所有转录产物以及转录物在细胞特定发育时期或特定生理条件下的表达水平 转录本主要包括mRNA，small RNA，non-coding RNA * * E-value告诉你产生这个Result多大程度上是因为随机性造成的。E-value越小越好。专业一点说就是，E值越小，结果越显著。 * 手动注释；实验验证；或者与已有家族的基因经过同源相似比对的序列。 * 氯烷烃和氯烯烃降解途径 * * 现在应用的比较多的是前三种机子 此图片来自Nature文献 * * * 测序仪品牌 技术原理 开发商 Roche 454 焦磷酸测序 Roche Illumina Solexa 边合成边测序 Illumina ABI SOLiD 基于磁珠的大规模并行连接测序 ABI Helicos 单分子荧光测序 Helicos Ion Torrent 半导体测序 ABI SMRT 单分子实时测序 Pacific Bio 现有主要高通量测序仪 转录组实验与测序原理 mRNA的提取 通过成熟mRNA的polyA结构提取组织样品的表达mRNA。 反转录为cDNA 将mRNA随机打断，通过利用反转录酶合成对应mRNA的cDNA 双端测序 将cDNA片段采用高通量测序仪进行Pair-End测序。 双端测序 cDNA片段化 Solexa双端测序 产生数据类型 成对Reads 测序一般流程(SOLEXA) ILLUMINA SOLEXA原理 桥式PCR 边合成边测序Sequencing by Synthesis 可逆终止物 HiSeq 2000 ILLUMINA SOLEXA 测序流程 a、Solexa 测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（Primer）,单链状态的 DNA片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端固定在芯片上； b、通过扩增反应使得单链 DNA成为双链 DNA； 文库制备：将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，并在两个末端加上接头（adapter）。 c、双链再次变性后成为单链，其一端固定在测序芯片上，另外一端（5’或 3’）随机和附近的另外一个引物互补，被固定住，形成“桥“(bridge)； d、在测序芯片上同时有上千万 DNA 单分子发生以上的反应； e、c 中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行扩增，形成双链； f、双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应； g、在反复进行 30 多轮扩增，每个单分子得到了 1000 倍扩增，成为单克隆“DNA簇群”； h、“DNA簇群”在Genome Analyzer IIx测序仪上进行序列分析； ILLUMINA SOLEXA BASE CALLING 1 2 3 7 8 9 4 5 6 T T T T T T T G T … T G C T A C G A T … RNA-SEQ技术路线 文库制备 测序 短序列定位 计数 转录组数据分析流程 转录组分析的两种策略 左边是先比对，再通过表达量和junction信息得到转录本，这种方法能够检测到低表达量的转录本； 右边是对mRNA-seq的reads直接进行de novo 组装，得到转录本，但对于低表达量的转录本不易发现。 转录组分析的两种策略 有Reference的转录组分析 以比对为基础，分析有基因组的样品的可变剪接信息，以及预测可变剪接带来的功能差异，同时定量不同样品的mRNA表达丰度进行差异基因的相关分析。 无Reference的转录组分析 通过测序数据组装大规模发掘对应物种的转录本信息，对组装得到转录本做功能注释分析，同时定量转录本的不同丰度进行差异分析。 两种分析思路 原始数据 Reference基因组 Gff基因结构注释 差异基因分析及功能注释分析 有参考基因组 无参考基因组 聚类得到Unigene Unigene的差异表达及功能注释分析 可变剪接结果 可变剪接作图 TopHat+Cufflinks的可变剪接分析 测序数据组装 差异基因聚类分析 差异基因功能注释 结构预测分析 差异基因聚类分析 差异基因功能注释 有参考基因组分析 可变剪接 根据软件对基因可变剪接结果做预测 结合相关基因的功能进行深入的研究（性状相关..） 原始数据 Reference基因组 Gff基因结构注释 TopHat+Cufflinks的可变剪接分析 可变剪接简介 一个基因在转录过程中经过不同的剪接处理得到不同的mRNA从而产生不同的蛋白，是生物性状多样化的重要原因。 可变剪接类型 外显子跳过