病毒的增殖与培养.ppt.ppt

2. 动物培养： 早期对病毒生物学特性的研究主要通过动物接种（鼠、兔、犬、牛、猴等）以培养病毒。目前动物接种仅限于研究病毒或毒株的致病性或为确切诊断某种病毒为病原体（如狂犬病毒及乙型脑炎病毒）。 3.鸡胚培养： 受精鸡胚培养仅限于个别病毒（如流感病毒）的分离培养，鸡胚的羊膜腔和尿囊腔可用以分离流感病毒。 （二）病毒的鉴定 1.细胞病变效应：接种标本后，细胞可出现病变，称细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。病毒的种类不同，出现的病变不同，常见病变包括细胞变圆、坏死、溶解、脱离或形成多核巨细胞，某些细胞内可见包涵体。 2.红细胞吸附：某些病毒（正粘病毒、副粘病毒）感染宿主细胞后可吸附脊椎动物的红细胞，出现血吸现象。这是因为感染细胞的细胞膜上含有能吸附红细胞的病毒抗原成分。 3.蚀斑形成：是目前测定病毒感染性及计数病毒颗粒较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养液中，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化的琼脂。病毒导致局限性病灶出现并不断扩大，肉眼也能看到。此即蚀斑（plaque），每个蚀斑由一个病毒体形成，称为蚀斑形成单位（PFU） 原代细胞培养是指自动物或人( 来自猝死、疾病或因治疗而流产胎儿的材料)组织直接用蛋白酶消化所获得的细胞，经培养后可贴管壁生长或悬浮生长（如淋巴细胞）。原代细胞对病毒的易感性高，主要作为自标本中分离病毒的工具。传代细胞分为二倍体细胞株和传代细胞系。可连续传代的细胞系或来自肿瘤组织（如HeLa细胞）或来自发生自发转化的原代细胞系（如中国地鼠卵巢细胞系，CHO）。这些细胞系的染色体为多倍体，与正常细胞不同。二倍体细胞则为在体外连续50－60代后仍保持其二倍染色体数目的细胞。经再连续传代，则二倍体细胞逐渐衰老而死亡。这种细胞株多数用人胚肺组织建立，既可用于分离病毒，也是人用疫苗生产中首选的细胞株。在用真核表达基因工程产品时则常用CHO细胞。 病毒的增殖与培养 一、病毒的增殖： 从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制，到释放出子代病毒，称为一个复制周期（replication circle）。 复制初期，病毒结构消失，进入隐蔽期。之后病毒在细胞内增殖，称为增殖期。病毒量增多的时间长视病毒种类而异。 （一）病毒复制周期 病毒复制周期(virus replication circle): 可分为五个阶段 吸附(Adsorption) 穿入(Penetration) 脱壳(Uncoating) 生物合成(Biosynthesis) 装配与释放(Assembly and Release) 几分至几十分钟，分两个阶段 （1）非特异性吸附：可逆的静电吸附 （2）特异性吸附：病毒蛋白与细胞膜受体特异 结合 1.吸附（Adsorption）： 2.穿入（Penetration） 融合（fusion）： 包膜病毒采用的方式之一，病毒包膜和细胞膜接触后发生融合，将病毒核衣壳释放至细胞质内。如：正粘病毒、副粘病毒等。 也有部分无包膜病毒表面位点与细胞受体结合后脱壳，核酸直接进入细胞。如：噬菌体。 穿入主要由三种方式： 融合、胞（吞）饮、直接穿入 胞饮（viropexis）或吞饮（endocytosis） ： 即病毒与细胞表面结合后，细胞膜内陷形成类似吞噬泡，病毒原封不动的进入细胞质。部分包膜病毒及多数无包膜病毒以吞饮方式进入细胞。 直接穿入： 病毒直接穿过细胞过，完整的进入胞浆。 3.脱壳（Uncoating） 除痘病毒外（脱壳酶），其余病毒在溶酶体作用下就可释放出核酸。核酸暴露后就进入生物合成阶段。 病毒脱壳后，在子代病毒颗粒形成前无法查到病毒颗粒或病毒抗原，称为隐蔽期（eclipse） 4.生物合成（Biosynthesis、隐蔽期） 复制早期，病毒基因组首先转录、翻译某些非结构蛋白，包括必须的复制酶和一些抑制细胞核酸与蛋白质合成的酶，以阻断宿主细胞的正常代谢。 复制晚期，病毒合成子代病毒的核酸以及结构蛋白 这一阶段并无完整病毒可见，也不能用血清学检测出病毒的抗原，因此曾被称为隐蔽期（eclipse）。 6大类型: 双链DNA病毒 单链DNA病毒 单正链RNA病毒 单负链RNA病毒 双链RNA病毒 逆转录病毒 合成区域： DNA病毒：核内（除痘病毒） RNA病毒：胞质（除流感病毒及逆转录病毒） 所有蛋白：均在胞质合成 （1）双链DNA病毒：人和动物的DNA