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免疫组织化学 掌握内容 免疫组化的基本原理 免疫组化的基本过程 免疫组化的染色技术分类 常用的免疫组化的染色原理和方法 注意事项 免疫组织化学的基本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用免疫学原理（特异的抗原抗体反应）来对组织内抗原（或抗体）的分布进行原位检测技术。 1．发展简史 1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功 60年代 Nakane建立酶标抗体技术 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。 80年代 Hsu 等建立了抗生物素的（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 免疫组织化学的优点 1、特异性强——免疫组化从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示 2、敏感性高——抗体稀释到几千分之一、上万分之一，甚至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合 3、定位准确，形态与功能相结合 4. 方法步骤统一——若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。　　　　 免疫组织化学的基本原理 应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究 基本过程 抗原提取 制备抗体 抗体标记 制备样品 免疫前样品处理 免疫反应 显色反应 观察分析 一、提取抗原（antigen，Ag） 生物化学各种方法提取抗原 一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体内外发生特异性结合的物质。 基本特性：一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是反应原性 抗原（antigen ，Ag） 表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope） 二、制备抗体 即多克隆抗体（PcAb） 单克隆抗体（McAb） 和基因工程抗体 抗体的储存 抗体的储存 三、抗体的标记物 荧光素——异硫氰酸荧光素（FITC）、异硫氰酸罗达明(TRITC);德克萨斯红；藻红素等 酶——碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等 金属：胶体金、胶体铁、铁蛋白等 亲和素、生物素、放射性同位素等 四、样品的制备 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞 标本的固定与保存 好的固定剂除能满足一般组织学固定目的外，还需要： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散 （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应 常用：10%福尔马林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛 混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液 固定方法 细胞表面抗原——新鲜冰冻切片，后固定于丙酮 单层细胞、病毒、细菌——冷丙酮、冷乙醇 细胞悬液——先固定，然后离心制成标本 可溶性抗原——甲醛蒸气 一般组织——新鲜取材、浸泡固定 切片方法 冰冻切片 石蜡切片： 乙醇脱水时间要短； 浸蜡要快，温度低于60℃； 玻片上要用黏附剂 蜡块尽快切片，密封保存在4℃； 染色前彻底脱蜡 一般为5μm 盖玻片、载玻片清洗干净，载玻片要涂黏附剂：明胶硫酸铬钾法、多聚赖氨酸等 五、免疫反应前的处理1、抗原修复 福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。 同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖。 因此，抗原修复是影响免疫组化染色结果的基本因素 抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术 抗原修复是指切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。 AR 非加热技术：蛋白酶消化或酸水解 加热技术：微波、水浴、高压锅 酶消化  (1)原理： 1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 2)断交联 胰蛋白酶：0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaOH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。 主要用于细胞内抗原的修复 胃蛋白酶 0.