军团菌的分离培养与鉴定-福建省疾病预防控制中心.ppt

* BCYE-Cys培养基 为不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制BCYE－α培养基的方法配制，不加L-半胱氨酸。 标本 肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物 水源 血清 处理与制备 水样处理与制备 血清学检测方法： *间接荧光抗体染色法 *试管凝集试验 *微量凝集试验（参考） *DOT-ELISA法 *间接血凝试验（参考） *ELISA法 接种军团菌BCYE培养基 接种军团菌选择性GVPC培养基 37℃，5%CO2，培养3-14天 挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检 37℃,5%CO2,培养3-14天 革兰氏染色阴性杆菌 革兰氏染色阳性杆菌 纯培养 弃去 确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测 生化试验 选择培养基的接种 一个GVPC培养基平板上可以接种0.1～0.5ml(浓缩或未浓缩) 未经处理的样品。 用无菌的涂抹器将液体均匀的涂抹在培养基表面。 用同样的方法尽可能快地将经过热处理的0.1～0.5ml标本接种在另外一块GVPC培养基平板上。 再用同样的方法尽可能快地将经过酸处理的0.1～0.5ml标本接种到第三块GVPC培养基平板上。 500ml水样 过滤浓缩法 将500ml水样于0.22um滤膜过滤然后放于5ml无菌水中超声波振动3分钟=浓缩样本 或 高速离心浓缩法 将200ml水样置于离心机6000g离心10分钟，15-25℃ =浓缩样本 直接涂布法 于GVPC（2个平板）上分别涂布0.2ml原液用PBS缓冲液0.01mol/L（PH7.2）稀释1：10的样本 酸处理法 2ml浓缩液+2ml酸缓冲液（PH2.0）摇匀5±0.5分钟 热处理法 2ml浓缩液于50±1℃水浴30±1分钟 直接涂布法 于GVPC平板上涂布0.1ml浓缩液，用PBS缓冲液稀释1：10的样本 涂布：0.2ml于GVPC平板 涂布：0.2ml于GVPC平板 孵育、平板观察及确认 接种标本培养 接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（36±1）℃培养7-10天。 为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。 在含2.5-5.0% CO2的环境下培养有利于军团菌的生长。 孵育 6个GVPC平板/每份样本 37℃，5%CO2，培养3-10天 菌落验证：从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种血平板 及接种BCYE和L－半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，35~37℃培养 2天，凡在BCYE琼脂平板上生长,而在L－半光氨酸缺失的BCYE 琼脂平板及血平板不生长的则为军团菌菌落。 平板的检查 观察结果：在3-10天的培养期间内，每2～4天至少观察3次，因为军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖。 军团菌菌落特点（1） 军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。 一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。 在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。 军团菌菌落特点（2） 嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色。 为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间。 值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。 军团菌菌落特点 可疑军团菌菌落的进一步鉴定 BCYE或其他培养基上传代培养 革兰染色镜检 生化鉴定 PCR检测军团菌特异性基因片段 免疫荧光的方法确定军团菌的种类 BCYE或其他培养基上传代培养（1） 至少从每块GVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。 在（36±1）℃至少培养两天。 凡是在BCYE培养基上生长而在BCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。 BCYE或其他培养基上传代培养（2） 营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-Cys培养基。如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。 橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-半胱氨酸和铁离子，但随后在L-半胱氨酸缺失时生长微弱。 BCYE培养基上传代培养 革兰染色镜检 军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.3～0.5μm，长约1.2～5μm或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。 短杆状 长丝状 军团菌生化鉴定 军团菌生化特性 生化试验 结果 触酶 －/弱+ 氧化酶 -/+ 硝酸