初步掌握遗传病的产前诊断实验设计原则。2-泸州医学院.ppt

核型分析 镜下核型分析，判断羊水细胞核型正常与否。 绒毛取样 分为经腹部取样和经宫颈取样。 经宫颈取样：B超检查确定胚胎大小、有无心血管搏动、在子宫内的位置；同时判别阴道的洁净度，防止取样导致宫内感染。用1‰新洁尔灭冲洗阴道后，用卵圆钳固定子宫颈，根据妇查及B超提示选择角度及深度将绒毛取样器伸到合适位置，抽出约10ml绒毛组织，立即注入盛有无菌生理盐水的玻璃器皿内。并在低倍镜下检查是否为绒毛。如果末查见绒毛而为蜕膜组织时，可换方位再行取材。 提取绒毛细胞DNA 1、清洗：取一干净培养皿，内加预温的（37℃）D-Hanks液10ml，将抽出的绒毛组织置于培养皿中，反复冲洗，去除血污。 2、DNA提取：按相应DNA提取试剂盒的要求提取DNA并检测提取DNA的纯度。 DNA印记杂交（Southern Blot） 为诊断传统技术。 利用α-珠蛋白基因探针（1.8kb）与经BamHⅠ和/或BglⅡ限制性酶切基因组DNA的印记杂交结果，可以明确诊断α-珠蛋白基因各种缺失突变基因型。 DNA印记杂交（Southern Blot） 为诊断传统技术。 利用α-珠蛋白基因探针（1.8kb）与经BamHⅠ和/或BglⅡ限制性酶切基因组DNA的印记杂交结果，可以明确诊断α-珠蛋白基因各种缺失突变基因型。 该法准确可靠，但操作繁琐，而且依赖同位素，难以推广。 裂口PCR（gap-PCR） 检测原理： 根据基因缺失后，在等位基因留下一裂口(gap)，在缺失区的两端各设计一条引物，当存在基因缺失时，扩增片段较正常等位基因短，或者因缺失区较大（通常2kb以上），正常等位基因无扩增带，借此鉴别基因缺失。 裂口PCR（gap-PCR） 设计8种PCR引物在α基因簇区域的位置。 裂口PCR法诊断α地贫示意图 A：人α基因簇物理图。实框代表功能基因，空框代表假基因。虚线表示- -SEA缺失区。图下方为引物位置。 B： α基因簇区同源（X,Y,Z box）和非同源区（Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ）及- α3.7、 - α4.2缺失区与PCR产物大小 裂口PCR（gap-PCR） 设计8种PCR引物在α基因簇区域的位置。 设计A、B、C、D四种不同的PCR反应体系，用高保真或长片段PCR扩增试剂盒（BM公司产品）扩增后，因基因型的不同，可得到不同大小片段的PCR产物，由此可对不同缺失型α地贫进行鉴别诊断。 等位基因 PCR反应体系 A B C D A4/A9 P51/P52 P51/P54 P55/P54 P71/P72 P71/P52 P55/P52 αα － 298 446 2271 － 233 1865 --SEA 570 － － － － － － -α4.2 － － 446 2271 1596 － － -α3.7 － 298 446 2013 － 233 1865 ααα3.7 － 298 446 2271 － 233 2123 α地贫gap-PCR产物大小（bp） 等位基因 PCR反应体系 B C D P55/P54 P71/P72 P71/P52 P55/P52 αα 2271 － 233 1865 --SEA － － － － -α4.2 2271 1596 － － -α3.7 2013 － 233 1865 ααα3.7 2271 － 233 2123 α地贫gap-PCR产物大小（bp） 裂口PCR（gap-PCR） 该法较Southern印迹法简便、快速，不需使用同位素。 但扩增反应结果与引物设计的好坏有关，还应注意PCR反应的假阳性和假阴性结果，应严格设置对照组，并避免交叉污染。 ? ?? ??1 ?2 ?1 5‘ 3’ 16pter-p13.3 1 31 32 99 100 141 缺陷类型 突变分子基础 基因型 Hb CS 142UAA（终止）→CAA（谷氨酰胺） α+ Hb QS 125CTG（亮）→CCG（脯氨酸） α+ 非 缺 失 型 α地贫产生的分子遗传基础 非缺失型基因诊断 突变性质已知： 可应用各种等位基因特异性PCR诊断技术对已知点突变性质的点突变进行诊断，如：PCR-ASO、PCR-SSCP、PCR-RFLP、PCR-DGGE等。 若点突变性质未知：则应全长筛查α-珠蛋白基因序列，才能发现可能存在的基因点突变。 YOUR SITE HERE 遗传病的产前诊断 医学细胞生物学与医学遗传