活性染色鉴定法.ppt

垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法） 实验原理 关于垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 关于连续系统和不连续系统 关于乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效应。它已成为目前生化实验室最常用的支持介质。以它为支持物发展起来的各种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，不仅能分离、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。 垂直板电泳 将配制好的凝胶溶液注入到两块垂直放置的玻璃板之间聚胶，然后加样进行电泳。 AP-TMTED催化体系 TEMED催化AP生成硫酸自由基： S2O82－ 2SO4·ˉ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： Bis将单体长链间连成网状结构： 凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。 蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同 聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 连续系统 是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。 关于乳酸脱氢酶 1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四聚体。 LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据之一。 乳酸脱氢酶同工酶活性染色 电泳装置 采用Pharmacia公司的SE250小型夹心式垂直板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置，两套电泳槽共用一台电泳仪。 操作步骤 一、样品制备： 断脊椎处死小鼠，取适量小鼠骨骼肌、肝脏、心肌和脑组织，加入5倍组织重的匀浆缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆，离心(10 000 r /min，15 min)，吸出上清液，加入等体积40 %的蔗糖（含少许溴酚蓝）混匀，放置4℃冰箱中备用。 制备连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方（两组） 其他注意事项 爱惜电泳装置，轻拿轻放，玻璃板必须用海绵清洗，避免产生划痕，损坏需赔偿。 染色液价格昂贵，按量发放（两块胶30mL）