光合细菌PSB的分离与培养条件优化研究.doc

光合细菌PSB-B4的分离与培养条件优化研究 摘 要:利用光合细菌处理有机污水是当前污水生物处理中的一种新方法。通过筛选,从污 水中分离得到一株生长较快、适应性较强的光合细菌菌株,标记为PSB-B4。通过菌落形态、培养特 征和菌体形态学观察,细胞吸收光谱及生理生化特性测定,初步鉴定为类球红细菌(Rhodohacter sphaeroides)。对这一光合细菌菌株的培养条件进行优化研究,最终确定菌株PSB-B4的最佳培养 基配方及培养条件为:酵母膏2.0 g,乙酸钠4.0 g,氯化铵2.0 g,蛋白胨3.0 g,磷酸氢二钾0.2 g,硫 酸镁0.2 g,氯化钠1.25 g,碳酸氢钠1.0 g,蒸馏水1 000 mL,pH=7.0,培养温度28e,光照强度 4 000 Lux,其中酵母膏对其生长影响最大。 关 键 词:类球红细菌;分离鉴定;培养条件 0 引 言 光合细菌(Photosynthetic bacteria, PSB)属于水圈微生物的一种,能充分利用光能和各种有机物作 为营养源进行自身的营养繁殖。菌体本身无毒,含有多种营养物质和生命活性物质,具有调节微生态平 衡、促进动植物生长、增加产量和提高质量等独特的生理功能。随着人们对光合细菌研究的不断深入, 证明光合细菌在农业生产及有机污水处理方面均有很好的应用价值。利用光合细菌处理有机污水,是 当前污水生物处理中的一个新的发展方向[1-3]。为了更有效地开发光合细菌这一尚未被充分的微生物 资源,使之在有机污水生物处理中发挥更大的作用,本文从污水中分离得到一株适应性强、生长较快的 光合细菌菌株,并对其进行了初步鉴定和培养条件优化研究。 1 材料与方法 1.1 材料 取沈阳北部地区某农场污水池浅层污泥。 1.2 方法 1)培养基 选择红螺菌培养基[5]作为富集分离基础培养基,培养温度选择28e[6]。 2)菌株的分离筛选方法 取泥样10 g装入150 mL三角瓶中,加入富集培养液至满,并覆盖一层无 菌液体石蜡,封口,在28e,3 000~5 000 Lux光照条件下培养7~10 d,至菌液颜色呈橙红色,取此富集 培养液10 mL,继续富集培养,重复以上操作2~3次,采用试管稀释培养法和双层平板培养法[7-8]对光 合细菌进行分离纯化,选取生长较快的菌株作为出发菌株。 3)活细胞吸收光谱的测定 取纯培养物5.0 mL,4 000 r#min-1离心5 min,用无菌生理盐水洗涤, 再离心、洗涤,反复3次,悬浮于60%蔗糖溶液中,采用紫外可见分光光度计扫描测定菌体,在波长范围 300~1 100 nm的吸收光谱峰值。4)分离菌株鉴定的依据 菌落形态观察、细胞形状观察、生理生化特性的测定参照文献[9-10]。 5)初始pH值对分离菌生长的影响 基础培养液配制pH=5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10,倒入同一规 格的无菌试管中,加入1 mL等量菌液,在28e,3 500 Lux条件下,光照厌氧培养7 d后测定OD660值。 6)不同光照强度对分离菌生长的影响 基础培养液的pH值设置为7.0,灭菌后倒入同一规格无 菌试管中,加入1 mL等量菌液,在28e条件下,光照强度分别设为:1 000,2 000,3 000,4 000,5 000 Lux,光照厌氧培养7天后测定OD660值。 7)培养基正交试验 选择酵母膏、乙酸钠、氯化铵、蛋白胨、微量元素5个因子进行分析,设计5因 素4水平的正交试验(表1)。培养基中其他成分:MgSO4#7H2O 0.2 g,K2HPO40.2 g,氯化钠1.25 g, NaHCO31.0 g,水1 000 mL,pH=7.0。在28e,4 000 Lux条件下培养7 d后测定OD660值。 表1 培养基正交试验因子水平表 水平A酵母膏/(g#L-1)B乙酸钠/(g#L-1)C氯化铵/(g#L-1)D蛋白胨/(g#L-1)E微量元素/(mL#L-1) 1 0.5 2.0 1.0 1.5 0.0 2 1.0 3.0 2.0 2.0 1.0 3 1.5 4.0 3.0 2.5 2.0 4 2.0 5.0 4.0 3.0 3.0 2 结 果 2.1 光合细菌菌株的筛选 经过10~14 d的培养,在培养基中出现圆形的铁饼状和点状菌株。挑取棕色铁饼状菌株9例,保 存命名编号为PSB-B1~PSB-B9,最终选择生长最快的PSB-B4作为出发菌株。 2.2 菌体形态和培养特征 图1 PSB-B4菌体活细胞吸收光谱 菌株PSB-B4革兰氏阴性,单个细胞为卵圆 形和杆形,二分分裂繁殖,极生鞭毛,有时排列成 规则链状,适中性环境下生长。在光照厌氧、黑暗 好氧及微好氧条件均能生长,光照厌氧液体培养 物由最初的浅黄色变为棕红色,瓶底和瓶壁出现 少量的棕红色沉