SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

6.上样： （1）marker 5μl （2）样品10 μl + 2×上样buffer 10μl 共20μl 100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性） 7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15μl  *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔 8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳  9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析 按下式计算相对迁移率：   每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性 = 蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 c m 溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 c m 相 对 迁 移 率 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 实验目的 了解电泳实验原理 掌握电泳实验操作规程 用电泳方法测定蛋白分子量 电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳基本原理： COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 电泳用于分离物质的原理： 带电颗粒在电场作用下所受的力： 电场力 F=XQ 阻力 F=6πγηυ 当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动: F= F? QX=6πηγν ν/X=Q/6πηγ 影响电泳速度的因素： 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度 分类 连续电泳 不连续电泳 非变性电泳 变性电泳 1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 分类 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。 （1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。 （2）凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。 浓缩效应 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸(慢离子) 8.3 样品 蛋白质 6.7 浓缩胶 Cl-(快离子) 6.7 大 分离胶 Cl-(快离子) 8.9 小 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 不连续电泳三大效应： 非变性电泳 变性电泳 测定亚基分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小 SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起