丹红抑制低密度脂蛋白处理的人脐静脉内皮细胞凋亡-步长制药.docVIP

丹红注射液/滴注液保护内皮细胞免受氧化损伤的体外研究( 满永* 丁莉* 国汉邦 王蕾 王抒 黎健△ (卫生部北京医院老年医学研究所，北京100730) [摘要] 目的：分析低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）和无血清培养刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)时细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4, NOX4）mRNA水平和细胞凋亡的变化；研究丹红注射液/滴注液保护内皮细胞免受氧化损伤的作用及机制。 方法：以MTT法观察丹红液对HUVECs生长的影响；应用RT-PCR检测NOX4的mRNA水平；用流式细胞仪分析细胞凋亡率；并以DCFH-DA法检测细胞内ROS生成量。 结果：高LDL和无血清培养等刺激HUVECs时，NOX4的mRNA表达上调，细胞内ROS生成增加，细胞凋亡增加。用丹红液预处理HUVECs可以拮抗LDL和无血清培养时的作用，降低NOX4 mRNA水平，抑制细胞内ROS生成和凋亡的发生。 结论：丹红液可以保护内皮细胞免受由LDL和缺血引发的氧化损伤。 [关键词]：人脐静脉内皮细胞 NADPH氧化酶 活性氧 丹红注射液 引言： 业已证明，血液中大量低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）在内皮下的沉积可导致内皮细胞损伤。LDL进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），引起氧化修饰LDL（oxidized low density lipoprotein, oxLDL）的形成，诱导内皮细胞凋亡[1]。在正常生理情况下，由于血液中存在抗氧化酶系统如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx），内皮细胞产生的ROS维持在较低水平，一旦大量LDL进入内皮细胞，则导致高水平ROS的产生和oxLDL的形成，并刺激内皮细胞产生ICAM-1和VCAM-1等粘附因子，造成炎症细胞浸润，加重血管内皮的炎症损伤。Lee[2]等发现无血清培养可增加ROS生成，导致细胞凋亡。这些研究提示ROS在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生过程中起重要作用。因此，探寻具有抗氧化作用的药物用于防治心脑血管病具有重要的临床意义和广阔的应用前景。本实验建立血管内皮细胞损伤模型，研究丹红注射液/滴注液保护内皮细胞的作用，侧重研究丹红液的抗氧化作用。 材料与方法： 1.人脐静脉内皮细胞分离培养。取长度约二十厘米的新鲜脐带，用生理盐水冲洗脐静脉后，以0.1%的Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉20分钟，收集灌注液，800转/分钟离心6分钟，收集内皮细胞到25cm2培养瓶中，加入M199混合培养基（5ml）在37℃含5%的CO2培养箱中培养，12小时后更换新鲜培养基，以后每隔2天换液一次，待第二、三代细胞长至亚融合状态时用于实验。 2.实验分组。无血清培养组 ：用无血清培养基培养HUVECs24小时；LDL处理组：以含有80mg/dlLDL的培养基培养HUVECs16小时；丹红液预处理组：用丹红注射液/滴注液（陕西步长公司产品，国药准字号ZZ预处理24小时后加入80mg/ml LDL继续培养16小时或在无血清培养基中培养24小时。 3.MTT法测定内皮细胞的生长。在96孔细胞培养板中每孔种入HUVECs 6-7×103个，总体积为200ul。培养24小时后加入不同浓度丹红溶液继续培养48小时，然后每孔加入0.5%的MTT20ul，4小时后弃去上清，加入150ul DMSO摇床震荡10分钟，用酶标仪测定波长570nm处吸光度。 4.流式细胞术分析细胞凋亡率：用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，PBS洗涤细胞一次，用70%的乙醇5ml固定细胞；800转/分钟离心5分钟，PBS洗涤细胞二次；加入含RNase A(终浓度50ug/mL)的PBS 500uL，37℃水浴孵育30分钟；再加入碘化丙啶(PI)，使其终浓度为50ug/mL，4℃避光30分钟；300目尼龙网过滤，用流式细胞仪检测，计数10000个细胞，测定凋亡的细胞数。 5.DCFH-DA法检测细胞内ROS水平。应用ROS检测试剂盒(上海碧云天试剂公司产品)，按照说明书的流程操作：用无血清的培养基冲洗细胞两次，加5ml无血清培养基和7μl DCFH-DA到25cm2的培养瓶中，在37℃含5%CO2的培养箱中孵育45分钟；P