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多肽组技术与应用 魏开华 北京蛋白质组研究中心 主要内容 背景介绍 多肽组样品制备 非原位多肽组研究 原位多肽组研究 应用示例 多肽组（peptidome）是指活体生物器官、组织、细胞和体液中的全部内源性多肽组份。多肽组学就是研究多肽组的结构、功能、变化规律及其相关关系的学科。多肽组学和蛋白质组学都是基因组学的补充，多肽组学填补了蛋白质组学与代谢组学(metabonomics)之间的“间隙（gap）”。标准的蛋白质组研究策略不适合多肽组研究，因为它们不能覆盖到较小的分子量区域。 Peptidomics 多肽组的生物来源： 动物体液：血、乳汁、脑脊液、胃液、尿液、精液、唾液、毒囊（如蜂毒、蝎毒、蜘蛛毒）等 动物组织：肝、脾、肾、血管、肠、海马、表皮、睾丸、卵巢、子宫、眼球等 某些植物：花粉、果汁、海藻等 血清包含蛋白质和小分子多肽、盐、类脂、氨基酸和糖等，数量达百万种，其中水90%～91%,蛋白质6.5%～8.5%和多肽2%左右。 多肽组研究 多肽组样品制备 非原位多肽组研究（血清多肽组） 原位多肽组研究（质谱成像） 血清处理的结果范例：SDS 血清处理的结果范例-MS ZipTip是一种末端带有约0.6μL层析介质的10μL吸管尖，因此不会出现死体积。它是质谱分析之前快速（数秒种）浓缩、脱盐和分馏多肽、蛋白质或寡核苷酸的好工具。 这种装置结构简单，使用方便。使用时，将其置于一个单管或多管的移液器、标准的22格钝端的HPLC针、或自动的液体操作/样品制备的工作站上。为了吸附样品，通过介质反复抽、吸几次。此时，污染物也以同样的方式被清洗掉。然后将浓缩、纯化后的样品用1-4μL相容的溶剂精确地洗脱，直接转移到质谱仪或小瓶中。对于那些要求较小洗脱量的应用（例如小于1μL），可用仅含0.2μL介质的微量规格。 特 点 1.可纯化及浓缩fmole~pmole的生物样本。样本需要少。 2.可以避免清去污剂和其他缓冲盐等对质谱分析的准确性及重現性的影响3.分离填料置于微量吸管(pipette tip)內操作方便 常用树脂种类及其应用 C18去除peptide，protein或oligonucleotides样本内的盐类及浓缩样品，增加MALDI-TOF MS的灵敏度及解析度 C4蛋白质去盐及浓缩 SCX去除样品中的清洁剂，浓缩含有机溶液的多肽 常用种类及规格 ZipTip脱盐通用步骤 （1）用50%ACN 中性溶液活化Millipore C18 ZipTip. 吸排5~10次。 （2）用0.1% 甲酸溶液平衡C18 ZipTip。吸排除5~10次。 （3）用2 ul 0.1% 甲酸溶解酶切产物，用C18 ZipTip 吸附肽段。吸排5~10次。 （4）用0.1% 甲酸溶液洗盐。吸排除2~3次。 （5）用4 ul 含0.1% 甲酸的50%ACN溶液洗脱肽段供质谱分析。2 ul/次，吸排2次。 金属亲和ZipTip磷肽处理步骤 不要有高浓度有机溶剂 金属亲和ZipTip磷肽处理步骤（1） 0.1% acetic acid or 0.01% formic acid with 10% acetonitrile 金属亲和ZipTip磷肽处理步骤（2） 金属亲和ZipTip磷肽处理步骤（3） 效果比较 多肽组研究的主要方向 非原位多肽组研究（血清多肽组） 原位多肽组研究（质谱成像） 典型的多肽组技术：非原位 MALDI-TOF-MS，LC-ESI-MS, Q-FT-MS 分析 ESI-CID, MALDI-TOF/TOF, MSn 测序 生物信息学软件分析、建模，早期诊断 多肽制备的核心问题一：重复性 同一例样品连续3天检测的重复性比较 方法可靠性研究 Normalized Peak Intensity Comparison 样本保存时间的比较(-80 ℃) 洗脱液的优化 FT-MS和MALDI-TOF-MS对样品处理要求差异很大 点靶条件的优化 样品和基质的比例 不同样品处理方法的比较 不同人员处理的比较 稀释效应 提问与解答： 蛋白组样品制备为什么不建议在后期进行浓缩和稀释？ 沉淀、溶解度、高级结构、离子强度、pH、动态范围、低丰度蛋白。等电聚焦。 多肽组可以进行适当的浓缩和稀释？ 3D display ClinProTools Classification BioMarker ？？？ m/z1460.847 sequence 多肽组研究的主要方向 非原位多肽组研究（血清多肽组） 原位多肽组研究（质谱成像） 经典的标志物研究思路 潜在的问题 提取完全吗？组成