培养基的配制与灭菌技术.doc

实验一 培养基的配制与灭菌技术 一、目的要求 1 掌握配制培养基的一般方法和步骤。 2 学习高压灭菌锅的操作方法。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NACL提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基，是由可溶性淀粉作碳源，KNO3作氮源，NaCl，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O，FeSO4.7H2O为微生物提供钠、钾、磷、镁、硫等离子。 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。通常为15磅/英寸2 (121.3℃)灭菌15—20分钟；不耐高压的培养基则可采用流通蒸汽灭菌或间歇灭菌。含糖培养基用112.6℃（8磅/英寸2）灭菌15分钟。 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；由于辐射能使空气中的氧电离成[O]再使O2氧化生成臭氧O3或使水H2O氧化生成过氧化氢H2O2，O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。 三、器材 天平，高压蒸汽灭菌锅电烘箱培养皿，试管，吸管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，牛角匙，pH试纸(pH5.5—9.0)，棉花，纱布牛皮纸，记号笔，麻绳 加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。 生理盐水的配置分装 用吸管量取相应体积的生理盐水。 7. 包扎 加塞后，将全部试管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一层牛皮纸或报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称，日期。 8. 灭菌 首先将内层灭菌筒取出，再向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞， 加盖，将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。 通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。 （5） 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 9. 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在木条上（见图Ⅰ－2）。 10. 倒平板 将培养基溶化，待冷至55－60℃时，将几种培养基分别倒平板，每种培养基倒三皿。手持法（见图Ⅰ－5）：右手持盛培养基的试管或三角瓶，置火焰旁，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。如果试管内或三角瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后，轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即可成平板。皿架法（见图Ⅰ－4）：将