荧光光谱-北京大学单分子与纳米生物学实验室.ppt

0.91 6.3 0.07 460 1.3 320 Yeas t-RNAPhe Y-base 0.08 6.4 0.04 282 0.2 257 H2O,pH7 Phe 1.4 3.6 0.1 303 1.4 274 H2O,pH7 Tyr 11 2.6 0.2 348 5.6 280 H2O,pH7 Trp 敏感度?max?F 10-2 ?F ns ?F ?em nm ?max 10-3 ?ex nm 条件 生色团 亚硝基奈酚+Tyr 茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Phe ?ex:460nm, ?em:570nm ?ex:365nm, ?em:515nm 四 荧光生色团的结构特点 五 影响荧光测量的因素 1 光化分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂——荧光减弱 2 淬灭(quenching) 温度淬灭： 温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。 浓度淬灭： 21 内滤光效应（inner filter effect) (3)杂质淬灭：3O2 1O2 3 溶液pH的影响 利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。 指示剂 颜色变化 pH范围 萘 酚 无色变黄绿 8.2-10.3 荧光素 浅绿变绿 4.0-5.0 丫啶橙 浅黄绿变黄 8.0-10.0 4 溶液极性的影响 荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向 （或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。 DPH 水溶液中 膜 中 发射波长：440nm 发射波长：430nm 5 溶剂和化学试剂 (1) 溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。 (2) 溶剂要纯 6 荧光污染 (1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞 (2) 去污剂 (3) 微生物污染 (4) 滤纸 六 荧光分光光度术的应用 (一）.物质的检测 1 测量原理： 稀溶液， F= ? I0εcL 2 结构特点：含有“芳香环”结构 3 灵敏度：10-7~10-8g/ml 550，330 295 5羟色胺，盐酸 330 295 5羟色胺，中性或弱酸性 403 381 3,4-苯并芘10-6g/ml 530 490 维生素C 305 275 维生素B12， pH7 565 370 维生素B2，pH7 490 345 维生素A 发射波长nm 激发波长nm 检测物质 研究生物大分子构象 （二）蛋白质的荧光分析 1 蛋白质的内源荧光 2 蛋白质的外源荧光 （三）核酸的荧光分析 １嘌呤及衍生物 室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。 　　　　　　　　　　　　　酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。 　　　　　　　　　　　　　碱性介质中，鸟嘌呤有荧光 ２嘧啶及衍生物 游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低Φ＝0.0015 3 核酸的荧光标记 透膜，DNA 460 345 Bisbenzimide 580 545 Pyronin Y 透膜，RNA,DNA 590 490 Acridine Orange 455 435 PO-PRO-1 iodine 615 530 Propidium Iodine 非透膜，RNA,DNA 610 545 Ethidium Bromide Note ?em ?ex Probes * 生物物理学的内容 分子生物物理学（Molecular Biophysics) 生物物理仪器与技术( Biophysical Instrumentation and Techniques) 膜与细胞生物物理学(Membrane and Cell Biophysics) 理论生物物理学(Theoretical Biophysics) 感官与神经生物物理学( Sensory and Neural Biophysics) 自由基与电磁生物物理学 荧光分光光度术 Spectrophotofluorimetry 一、荧光的发现 二、荧光与荧光光谱 三、荧光光谱仪及主要谱参量 四、荧光生色团的结构特点 五、影响荧光测量的因素 六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用 荧光分光光度术 夜明珠发光成因 1、矿物的发光性 矿物在外来的能量激发下