牛精液冷冻损伤的研究进展.doc

牛精液冷冻损伤的研究进展 王彦平 张晓霞 张海涛 刘玉 胡志刚 (北京奶牛中心种公牛站，延庆基地 102100) 20世纪40年代，在奶牛生产中首次成功地应用了人工授精技术，目前人工授精在世界奶牛中的应用面在90%以上。人工授精对于育种的重大意义在于，借助它将优秀公畜的遗传物质通过冷冻，在时空上不受限制地传递到任何地方。 随着人工授精技术的发展，精液冷冻技术逐渐成为畜牧养殖业最为有价值的技术和管理手段。精液冷冻技术高效利用了优秀种公畜个体的大量精子资源，极大的增加了遗传进展并提高了繁殖效率，减少了疾病的传播。该技术成为今天世界范围的现代化养牛业的基础。 1776年意大利的Spallanzani首次观察到自然界的冰雪等低温物质对人类精子的影响，直到英国的Polge和Parkes及Smith(1949)在保护剂中添加甘油的效果的发现，为现代精液保存技术和AI技术的发展奠定了基础。在随后的50多年中，冷冻精液技术发展十分迅速，其在家畜动物、特种经济动物以及野生动物的繁殖和种子资源的保护中也得到极大的发挥。 但直到先在，精子冷冻自早期获得成功后，并没有获得根本性的改进。人们逐渐了解到冷冻解冻后的精子即使膜完整且活动正常，其功能明显与鲜精不同。如果冷冻解冻精子像鲜精一样使用，并获得较高的受胎率，就需要对稀释液配方甚至是冷冻技术进行较大的改进。 在精液冻融过程中，精子的外周环境发生了巨大的变化。即便使用优化的精液冷冻方案，仅一部分精子能存活，在存活的这部分精子中也存在不同的功能损害。Watson(2000)在总结精子受精率与具备正常功能的活精子数的关系时认为：只有正常功能的精予数达到一定临界值时，精子的受精能力才能得到保证。根据此关系，只有提高冷冻精液中正常功能的活精子数目，方能使精子库输出的精液质量得到提高。另一方面：也就是说，我们不仅要注意提高精子冻融后的存活率，更要注意保护精子的功能。 当精子细胞遭受冻融后，细胞内及细胞间形成冰晶与冰晶融化是造成细胞损伤的原因之一。如果在低温保存组织过程中，需要在精液中加入冷冻保护剂，它们也可对生物膜产生一定的损伤，例如二甲亚砜对细胞有毒害作用，温度越高，毒害越大。这两个损伤因素均可使细胞的形态结构与功能发生改变，尤其对生物膜（如细胞膜，高尔基体膜，线粒体膜）的影响更为明显。细胞膜上的膜蛋白变性，改变了膜脂和蛋白质之间的相互作用。膜的透性改变，钠离子和钾离子的透性加大，钾离子与钙离予发生置换，降低了膜的稳定性，细胞表面的电荷改变。质膜和细胞内的酶活性降低。线粒体膜破坏，氧化磷酸化偶联化解，能量代谢紊乱，减少了能量供应。冰晶融化后大量水分又被吸入细胞，胞内与胞外充水，形成了缺氧的微环境。最后导致生物膜的破损，细胞合成DNA、RNA和蛋白质的能力下降，表现出细胞的活力明显降低，最终细胞受损死亡。 冻融后存活的精子也存在不同程度和不同类型的功能障碍，例如，冻融后部分精子出现获能样变化，顶体内容物排出，这种变化与真正在受精前获能与顶体反应是不同的，出现这种变化的冻融后精子可能存在受精功能障碍；冻融后精子的活动率明显下降；冻融后膜的完整性受损；冻融后膜蛋白出现聚集，影响膜受体与配体相结合；精子细胞核内携带的遗传物质在冻融后出现损伤，可能会引起胚胎早期死亡。 1．质膜损伤 精子中有不同形式的膜，如质膜、线粒体膜、顶体膜等，这些膜在精子形成和附睾修饰成熟过程中，蛋白质和脂类发生不同的整合。膜的结构是由各种成分决定的，任何改变这种互相作用的过程都会改变它们的功能。温度可以通过影响膜构象来改变细胞的生物学特性。而且各部分质膜对冷冻的敏感性不同。精子冻存时必须首先考虑各种不同的膜的结构和功能，生物膜对冻融有高度的敏感性，是细胞受到伤害的主要部位。低温对膜的伤害主要是形成的冰晶对膜造成挤压撕裂，从而造成机械损伤。由于水分大量结成冰晶，以致溶质浓度不断升高，产生盐害，使膜的结构遭受不可逆的变化。膜的选择透性改变，发生泄露现象。冷冻也可使蛋白质从膜上释放出来，甚至可达到膜蛋白总量的5％，同时伴有酶的释放和失活。 在生物膜双分子层中，每一层都有独特的脂类一蛋白质分布方式，并且均和膜功能有着潜在的关系，甚至对冷冻复苏过程中出现的任何结构和排列变化有独特的敏感性。精子质膜完整性是精子能够新陈代谢，完成获能、顶体反应以及与透明带（ZP）结合并穿过ZP的基础。因此，精子质膜功能是否完整是区分精子死活的一个重要特征。然而精子质膜又是精子然而精子质膜又是精子最易损伤的部位。目前检测精子质膜的方法主要有3种：低渗肿胀试验法、常规染色法和荧光探针染色法。 2．线粒体损伤 线粒体是细胞内物质氧化和能量转换的场所，是细胞的“动力工厂”，生成ATP的主要地点，细胞生命活动所需能量的80%是由线粒体提供的。