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现代生化技术实验 生物工程教研室编 二零零五年二月 实验一 蛋白质的性质（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应 目的： 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、呈色反应 （一）双缩脲反应： 1、原理：尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽）。可用于蛋白质的定性或定量测定。 2、材料与试剂：尿素 10g；10％的氢氧化钠溶液 250ml；1％硫酸铜溶液 60ml；2％卵清蛋白溶液（或鸡蛋清溶液蛋清：水＝1:9） 3、操作： （1）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素溶化。溶化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。 （2）冷却后，加10％氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴。观察颜色的变化。（注意避免硫酸铜过量） （3）向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10％氢氧化钠溶液约2ml,摇匀，再加1滴1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察颜色的变化。 （二）茚三酮反应 1、原理：所有的a-氨基酸（除脯氨酸、羟脯氨酸外）都能与茚三酮反应生成蓝紫色物质。整个反应分两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜条件为5——7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同PH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 2、材料与试剂：蛋白质溶液：2％的卵清蛋白或新鲜鸡蛋蛋清溶液（蛋清：水＝1：9） 100ml；0.5％甘氨酸溶液 80ml；0.1％茚三酮溶液 50ml；0.1％茚三酮－乙醇溶液 20ml。 3、操作： （1）取2支试管分别加入蛋白质溶液合甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1％的茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1－2分钟，观察颜色由粉色变红色再变蓝。 （2）在一小块滤纸上滴一滴0.5％甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1％茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 （三）黄色反应 1、原理：含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 2、材料与试剂：鸡蛋清溶液（100ml）：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用6层纱布过滤；大豆提取液（100ml）：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤；头发；指甲；0.5％苯酚溶液 50ml；浓硝酸 200ml；0.3％色氨酸溶液 10ml；0.3％酪氨酸 10ml；10%氢氧化钠溶液 100ml 3操作： 向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各试管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温逐滴加入10％氢氧化钠至碱性，观察颜色变化。 管号 1 2 3 4 5 6 7 材料 （滴） 鸡蛋清溶液 4 大豆提取液 4 指甲 少许 头发 少许 0.5％苯酚 4 0.3％色氨酸 4 0.3％酪氨酸 浓硝酸（滴） 2 4 40 40 4 4 4 现象 （四）考马斯亮蓝反应 1、原理：考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。特点：染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.01－1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 2、试剂：蛋白质溶液（鸡蛋清：水＝1：20）；考马斯亮蓝染液（考马斯亮蓝G250100g溶于50ml95％乙醇中，加100ml85％磷酸混匀，配成原液。临用前取原液15ml，加蒸馏水至100ml,用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01％。 3、操作：取2支试管，按下表操作 管号试剂 蛋白质溶液（ml） 蒸馏水（ml） 考马斯亮蓝 1 0 1 5 2 0.1 0.9 5 实验（二）蛋白质的性质实验（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应 蛋白质等电点的测定 目的：了解蛋白质的两性解离性质；学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2、原理：蛋白质是两性电解质，