易卒中型肾血管性高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化引起脑白质病变的机制研究.doc

易卒中型肾血管性高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化引起脑白质病变的机制研究 易卒中型肾血管性高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化引起脑白质病变的机制健康清洁级Wistar大鼠60只，假手术组、4周8周组12周组、20周组、30周组各10只。脑白质病变Loyez染色法观察神经纤维假手术组胼胝体尾核内胼胝体胼胝体胼胝体尾核Loyez神经纤维排列整齐；模型8周组大鼠的Loyez神经纤维排列出现紊乱；模型12周组可见空泡样改变；模型20周可见脑白质出现明显疏松，神经纤维断裂；模型30周组脑白质疏松更为明显。结论 易卒中型肾血管性高血压大鼠毛细血管内皮细胞易卒中型肾血管性高血压大鼠易卒中型肾血管性高血压大鼠1 材料与方法 1.1 实验动物 健康清洁级Wistar大鼠60只，，体重70~100g，由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号：桂检字(2003)：第0005，本实验严格按照《实验动物伦理审查指南》中的规定进行。随机分为假手术组、4周组、8周组、12周组、20周组、30周组，每组各10只。 1.2 模型建立和血压测量 根据已定型的双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压大鼠；假手术组采取未钳位夹肾动脉。在不同时间点使用BP-2000型大小鼠无创血压计（上海玉研科学仪器有限公司）经尾动脉测定大鼠收缩压。 1.3 脑白质病变分级 使用10%的水合氯醛麻醉大鼠，剂量为400 mg/kg，经左心室向主动脉插管，剪开右心房，迅速灌注150ml生理盐水，至右心房流出无血澄清液体后使用4%多聚甲醛300mL联合0.1mmol/L 磷酸缓冲液固定脑组织，开颅将脑组织取出后固定1h，梯度蔗糖溶液脱水；包埋后置于冷冻切片机切片并进去HE染色。置于光学显微镜下观察脑白质病变情况，病变分级标准如下：0级：正常；Ⅰ级：神经纤维相互缠绕；Ⅱ级：有明显空泡样改变；Ⅲ级：髓鞘的神经纤维消失。 1.4 毛细血管内皮细胞观察 按照1.3的方法开颅取脑，取出脑白质胼胝体后立即放于固定液中。根据电镜操作标准过程制作超薄切片、半薄切片，铀铅双染后加速电压90 kV条件下使用 日立H-7650型透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构的变化情况。 1.5 白蛋白渗出检测 采取间接免疫荧光法检测，先于枸橼酸中修复抗原，在室温条件下于兔血清中孵育1.5h。将血清吸干后滴加稀释过的绵羊白蛋白抗体，置于4℃环境中孵育过夜。用0.1mmol/L 磷酸缓冲液洗净后，滴加兔抗绵羊二抗，避光条件下孵育1h，洗净后使用抗荧光淬灭封片液进行封片，置于荧光显微镜下观察并拍照。 1.6 Loyez神经纤维染色 将冰冻切片置于4%的铁明矾溶液1d，蒸馏水洗5~10次，使用新配置的碳酸锂苏木素染液浸染1d，置于1%盐水乙醇分化20s，流动水清洗至返蓝为止。70%、95%、100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，封固后置于光学显微镜下观察。 1.7 统计学分析 计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较进行t检验，多组间比较进行方差分析，采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，以α=0.05为校验水准。 2 结果 2.1 易卒中型肾血管性高血压大鼠血压监测情况假手术组易卒中型肾血管性高血压大鼠血压（）分组 不同时间点血压水平 术前 术后4周 术后8周 术后12周 术后20周 术后30周 假手术组 95.9±7.8 99.1±11.7 106.6±8.9 112.7±11.3 113.1±12.4 115.0±4.7 模型组 96.4±6.5 139.2±12.7 170.1±9.5①② 190.4±14.7① 196.8±15.7① 208.3±12.6① 注：与假手术组相比，①P0.05；不同时间点两两相比，②P0.01 2.2脑白质病变分级脑白质病变分级胼胝体尾核内胼胝体尾核内胼胝体脑白质病变分级（）分组 胼胝体 尾核 内囊 外囊 假手术组 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 4周组 0.5±0.1 0.3±0.1 0.3±0.2 0.3±0.2 8周组 0.9±0.2 0.5±0.1 0.3±0.1 0.3±0.2 12周组 1.5±0.1 1.0±0.2 0.3±0.2 0.5±0.2 20周组 2.4±0.1 1.6±0.1 0.7±0.1 1.0±0.2 30周组 2.8±0.1 1.9±0.1 1.4±0.1 1.4±0.1 白蛋白渗出检测4周组、8周组、12周组胼胝体胼胝体尾核Loyez神经纤维染色Loyez神经纤维排列整齐；模型8周组大鼠的Loyez神经纤维排列出现紊乱；模型12周组可见空泡样改变；模型20周可见脑白质出现明显疏松，神经纤维断裂；模型30周组脑白质疏松更为明显。详见图1。 图1神经纤维染色胼胝体胼胝体胼胝体[2] Jalal FY,Ya