课件7：荧光PCR系列产品操作培训.ppt

传统PCR 实时荧光PCR 实时荧光PCR 常用荧光标记 TaqMan水解探针作用机理 实时荧光PCR 实验原理 扩增曲线 四个阶段 基线 阈值 Ct值 【DNA】0 基线 阈值 Ct值 【DNA】0 基线 阈值 Ct值 【DNA】0 基线 阈值 Ct值 【DNA】0 起点定量 终点定量 HPV系列产品 样本类型采集方法 宫颈脱落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞。 男性尿道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。 男女性疣体标本 既可以直接切下疣体组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射器把疣体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处脱落细胞置入无菌玻璃管，密闭送检。 特殊样本 TCT采集系统样本：可以使用，但可根据所剩细胞浓度 竞品采样系统样本：亚能、港龙等采样系统样本均可用，HC2采样系统要确保未经过处理方可使用 采样前注意事项 样本保存 DNA提取 针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致 DNA质量要求 匹基、达安等都是使用直接煮沸法提取的DNA， 可直接使用 使用过柱法试剂盒，比如QIAGENE提取的DNA，也可以使用 PCR试剂配制 按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装 对照设置 操作注意事项 仪器检测通道选择 STD系列产品 样本类型采集方法 宫颈脱落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞。 泌尿生殖道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。 样本保存 DNA提取 针对泌尿生殖道样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致 PCR试剂配制 按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装 对照设置 操作注意事项 仪器检测通道选择 乙肝病毒定量产品 样本类型采集方法 血清样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于无菌收集管中，室温放置不超过4 h， 1500 rpm离心5 min，吸取血清转入1.5 ml离心管中备用。 血浆样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于含有EDTA作为抗凝剂的无菌收集管中，室温放置不应超过4 h，1500 rpm离心5 min，吸取血浆转入1.5 ml离心管中备用 样本保存 DNA提取 1）取200ul样本于1.5ml离心管中 （血清/血浆/阴阳质控品/阳性标准品)； 2）加入20ul蛋白酶K； 3）加入200ul溶液L，混匀，56℃温浴10-15min； 4）加入200ul无水乙醇，充分混匀； 5）将全部液体转移至带收集管的硅胶柱中； 6）10000rpm离心1min，弃废液； 7）加入500ul溶液W1（确保已加入乙醇）； 8）10000rpm离心1min，弃废液； 9）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）； 10）10000rpm离心1min，弃废液； 11）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）； 12）10000rpm离心1min，弃废液； 13）空管离心，12000rpm离心3min，丢弃收集管； 14）将硅胶柱装入新1.5ml离心管中，开盖1-2min； 15）往硅胶柱中心加入60-200ul的TE，静置3-5min； 16）12000rpm离心2min，弃柱得DNA。 PCR试剂配制 按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装 对照设置 操作注意事项 仪器检测通道选择 整体操作流程 结果分析 结果分析 常见故障排除 异常扩增曲线 扩增曲线出现交叉 扩增曲线平台期低 扩增曲线指数增长期异常 扩增曲线不光滑 扩增曲线呈直线上升 扩增曲线呈直线上升 阴性对照产生较高荧光 标准曲线线性关系不佳 精密度差 实验室管理规范 样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱4℃存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。 一周后检测的标本应保存在-20 ℃。 棉拭子样本应在真空管中保存，要操作前再加生理盐水/细胞保存液进行洗脱。 取800ul样本离心得沉淀 ↓ 加入细胞裂解液50ul，煮沸10min ↓ 12000离心10min即可上机