课件8：地贫操作培训2013.04.pptVIP

成人男性和女性及患儿外周血及血斑 抗凝外周血全血(不可用肝素抗凝)。抗凝血在2-8℃存放7天以内；在-20℃或 -80℃；保存时保存时间可至两年以上，但要避免反复冻融。滤纸干血斑样本：制备完成的采集卡常温、干燥、避光最多可保存3周， 2℃~8℃可保存一个月， -20℃可保存三个月。 羊水 羊水穿刺检查宜在孕16～21周进行。2~8℃保存不超过24h，-20℃或 -80℃其保存时间可至半年以上。建议先将羊水离心收集细胞后，倒掉上清再冷冻保存，以免细胞裂解，核酸释放到液体中，影响DNA产量。? 绒毛膜 早孕绒毛采样检查宜在孕8～11周进行。2~8℃保存不超过24h，-20℃或 -80℃其保存时间可至半年以上 地贫扩增的片段较长且为多重PCR扩增，对PCR仪质量要求较高，建议选用进口PCR仪(推荐使用ABI和Eppendorf PCR仪) 注意区分a-地贫和β-地贫的PCR扩增程序，否则会造成试验失败 最好选用进口PCR管，PCR管避免长时间在紫外线下照射，在上机前应确保PCR管底无气泡 PCR扩增完成后可在4℃暂存，如需过夜放置，需将PCR产物放置在-20℃ 所有检测结果都应与临床数据结合起来分析（至少有血常规中MCV，MCH指标），只有α-地贫基因型为-α3.7/αα与-α4.2/αα还有ααWS/αα（这3种基因携带者临床上几乎无症状），血常规MCV、MCH指标可能正常， 其他基因类型的地贫携带者其MCV、MCH指标（MCV80fl和或MCH26pg）有异常。 对杂交信号不强、背景不好的试验结果，需谨慎对待；特别是位于膜条四角的杂交点（41-42N、βEN、SEA、27-28M），如无法确定是否有杂交信号需重做。 对于中间型或重型β地贫（β地贫双重杂合子或突变纯合子），结果判读时需谨慎对待，如与其它临床数量不符（如血常规参数、受检者年龄等）建议重检。 凯普技术支持中心 2013.04 凯普地贫产品操作培训 适用样本及保存时间 抗凝血全血样本DNA提取方法 血液取样前应混合均匀 裂解过程中最好颠倒几次，有利于裂解充分 加4度冰冻的无水乙醇可提高DNA回收效率 TE洗脱液可稍微加热，并将洗脱液加至硅胶膜上静置再进行离心洗脱，有利于提高DNA的回收率。 羊水样本DNA提取方法 1）取5-10ml羊水样本，放入合适的离心管中，4000rpm离心10min 2）去上清，在离心管中加入400ml的生理盐水或溶液P，混匀 3）取步骤2中的溶液200ul，下同血液DNA提取方法。剩余标本保存，以备复查使用 血斑样本DNA提取方法 以下步骤同血液DNA提取相同 MIX Taq酶 模板 α 43.5μl 0.5μl 6μl β 46.5μl 0.5μl 3μl 注意： 1，解冻完全的MIX试剂和-20℃保存的Taq酶取出后需点动离心（必须！），二者按相应的比例混合后，轻力混匀，点动离心。Taq酶不能在室温放置时间过久 2，因MIX和酶在混合后分装过程中会有损失，建议在配试剂时α按44μl，β按47μl计算 3，若DNA质量不佳，在加模板时可适当加大模板量1-3μL 4, MIX应避免反复冻融 扩增体系的配置 扩增注意事项 杂交过程及其注意事项 同一样本的α，β扩增产物加在一个反应室内 WB1清洗时一定要用低速排液 杂交过程及其注意事项 杂交过程中实时问题处理参见21分型产品 结果判读 27/28M 31M α4.2 QSM CSM SEA IntM WSM α3.7 QSN CSN NP CapM -29M IVSI-5M IVSI-1Mt 14/15M 43M βeM -28M 71M 654M 17M 41/42M βeN -28N 71N 654N 17N 41/42N 地贫结果判读需谨慎对待！ 结果判读 地贫结果判读需谨慎对待！ 免费测序范围 1 检测结果为试剂盒中未获得SFDA认证的地贫类型 【IVS-I-5(G-C)、Cap(-AAAC)、Int（T-G）、CD31(-C)、WSM（CACCAG）】，临床医生要求测序确定的 2 检测结果为没有设置正常对照（27-28M、IVS-I-1M、IVS I-5M、CapM、IntM、31M），需确定是突变杂合子还是突变纯化子的突变型别 3 检测结果与其它产品不一致 4 检测结果为β-地贫中